بخشی از مقاله
چکیده:
اﳚاد موتاسیوهناي مصنوعی به منظور پدید آوردن تغیﲑاتی در رمز ژنتیکی موجودات ﳐتلف جهت مقاصد گوناگون به چندین دهه قبل باز می گردد. امروز با پیشرفت تکنیکهاي مهندسی ژنتیک، روشهاي ﳐتلفی جهت اﳚاد موتاسیوهناي هدفدار ابداع گردیدند. این تکنیک ها در بررسی ساختار پروتئینها، جایگاه فعال آنزﳝها و دستکاري تواﱄ هاي خاصی بر روي مولکول DNA، آاربردهاي فراوانی دارند. از ﲨله این روشها، تکنیک SOE می باشد آه با ﲠره گﲑي از واآنش زﳒﲑه اي پلیمراز قادر به اﳚاد انواع موتاسیوهناي نقطه اي بر روي مولکول DNA می باشد. از سوي دیگر پروتئﲔ فلورسنت سبز - GFP - آاربردهاي بسیار گسﱰده در ﲢقیقات مهندسی ژنتیک دارد و از آن به عنوان ژن گزارشگر، اتصال به پروتئﲔ هاي دیگر و بسیاري موارد دیگر استفاده می شود. با توجه به اینکه ﳏل
شناسائی آنزﱘ NcoI بر روي ژنGFP mut1 قرار داشت و حضور این مکان به عامل ﳏدود آننده در استفاده از این ژن تبدیل شده بود، با طراحی 4 پراﳝر بر طبق متد SOE و با اﳒام واآنشهاي زﳒﲑه اي پلیمراز اقدام به حذف ﳏل برش آنزﱘ NcoI بدون اﳚاد تغیﲑ در رمز اسیدهاي آمینه در ژن فوق الذآر گردید. سپس این قطعه درون سلول باآﱰیائی آلون گردید، نتایج هضم آنزﳝی و تواﱄ یابی تائید آنندة حذف این ناحیه از روي ژنGFP mut1 بود.
مقدمه:
پدید آوردن جهش هاي مصنوعی در موجودات ﳐتلف به منظور اﳚاد تغیﲑاتی در رمز ژنتیکی آهنا سابقه اي طولانی دارد. جهش هاي مصنوعی از دیدگاه ﳓوة به وجود آمدنشان به دو دسته جهش هاي تصادﰲ و جهش هاي هدفمند - Site directed mutation - تقسیم بندي می شوند. اآثرموارد اولیه اﳚاد موتاسیون به اﳚاد موتاسیون هاي تصادﰲ ﳏدود می گردید. امروزه با پیشرفتهاي گسﱰده اي آه در تکنیک هاي DNA نوترآیب پدید آمده است اﳒام انواع بسیار متنوعی از جهش هاي هدفمند امکان پذیر گردیده است. یکی از روشهاي مورد استفاده به منظور دستکاري قسمتهاي خاصاز مولکول DNA، تکنیک SOE overlap extension - - Spliced می باشد. در این تکنیک آه از آزمون زﳒﲑه اي پلیمراز - PCR - ﲠره می گﲑد،
قطعاتی از ژن مورد نظر آه می بایست تغیﲑات مورد نظر - حذف، جاﲜائی و یا اضافه ﳕودن یک یا تعدادي باز - بر روي آن اﳚاد شود به صورت ﳎزا و به ﳓویکه هر قطعه داراي تغﲑات مورد نظر باشند تکثﲑ می گردند. پراﳝرهائی آه براي تکثﲑ این قطعات مورد استفاده قرار می گﲑند به ﳓوي طراحی می شوند آه داراي تواﱄ هاي مکمل یکدیگر باشند. زمانیکه این ﳏصولات PCR با یکدیگر ﳐلوط می شوند پس از دناتوره شدن و سرد شدن ﳎدد، رشته هائی آه در انتهایشان داراي تواﱄ ﳘپوشان هستند به یکدیگر متصل شده و براي یکدیگر نقش پراﳝر را بازي می آنند. در نتیجه پس از تکثﲑ قطعه هنائی، این قطعه به دست آمده داراي جهش مورد نظر در ﳏل از پیش تعیﲔ شده می باشد. از این تکنیک تا به امروز در موارد بسیار ﳐتلفی از ﲨله بررسی ساختار پروتئﲔ ها، بررسی جایگاه فعال آنزﱘ ها و اضافه و یا حذف ﳕودن تواﱄ هاي خاصی از روي مولکول DNA استفاده شده است . - 3 - از سوي دیگر با توجه به آاربردهاي بسیار گسﱰده اي آه پروتئﲔ فلورسنت سبز - GFP - در ﲢقیقات مهندسی ژنتیک دارد و از آن به منظور ژن گزارشگر و اتصال به پروتئﲔ هاي دیگر - 5 - و بسیاري موارد دیگر استفاده می شود بنابراین حضور جایگاه شناسائی آنزﱘ هاي برشی معمول آه به صورت روزمره از آهنا جهت ساخت سازه ها و وآتورها مورد استفاده قرار می گﲑند، می تواند به عامل ﳏدود آنندة در استفاده از این ژن تبدیل شود. هدف از ﲢقیق پیش رو این بوده است آه با استفاده از تکنیک SOE بتوان بدون تغیﲑ در رمز آمینو اسیدي ژن EGFP - GFPmut1 - ، ﳏل برش آنزﱘ NcoI را از روي این ژن حذف ﳕود.
مواد و روشها:
ژن EGFP مورد استفاده در این ﲢقیق نسخهGFPmut1 بود . - 1 - با بررسی هاي اﳒام گرفته مشخص گردید آه تبدیل تواﱄ باز 168 از A به - A168T - T منجر به حذف جایگاه برش بدون تغیﲑ در رمز اسیدهاي آمینه ژن فوق می شود. بنابراین به منظور اﳒام تغیﲑ فوق و با در نظر گرفﱳ قوائد آلی طراحی پراﳝر - 4 - ، چهار پراﳝرp1، p2، p3 و p4 طراحی گردیدند - ﳕودار ﴰارة 1A جایگاه ﴰاتیک پراﳝرها بر روي ژن EGFP را نشان می دهد - . پراﳝرهايp1 و p2 پراﳝرهاي انتهائیEGFP بوده و ﳘچنﲔ دو پرایمر p3 و p4 بر طبق روش - 2 - SOE صرفاً جهت حذف جایگاه برش آنزﳝی NcoI از روي ژن EGFP طراحی شدند پراﳝرها به ﳓوي طراحی گردیدند آه پراﳝرهاي p1 و p2 در واآنش PCR با یکدیگر سازگار باشند، ﳘچنﲔ پراﳝرp1 با پراﳝر p4 و پراﳝرهاي p2 و p3 با یکدیگر سازگار باشند.
سازگار بودن پراﳝرها با یکدیگر، عدم تشکیل داﳝر پراﳝر و عدم حضور لوپ در آهنا به آمک نرم افزارهاي Oligo و Oligo analyzer مورد بررسی قرار گرفت. در مرحله بعد با استفاده از آنزﱘ Pfu و با به بکارگﲑي پراﳝرهاي p1 و p3 قطعه α و با استفاده از پراﳝرهاي p2 و p4 قطعه β تکثﲑ گردیدند. سپس ﳏصولات PCR به صورت جداگانه بر روي ژل آگارز %1 رانده شده و با استفاده از کیت استخراج DNA از ژل آگارز، قطعات α و β از ژل خالص سازي شدند. در مرحله بعد این دو قطعه α - و - β با استفاده از واآنش زﳒﲑه اي پلیمراز و با بکارگﲑي آنزﱘ Pfu به یکدیگر متصل شدند. به منظور مقایسه اندازه، ژن تکثﲑ شدة حامل موتاسیون به ﳘراه ژن EGFP فاقد موتاسیون بر روي ژل آگارز رانده شدند. سپس قطعه تکثﲑ شده درون سلول E.coli آلون گردید. به منظور مطالعه ﳓوة اﳒام موتاسیون مورد نظر، ژن حاوي موتاسیون با استفاده از پراﳝرهاي p1 و p2 تکثﲑ شد و به ﳘراه آنﱰل منفی - ژن EGFP حاوي جایگاه برش - NcoI با استفاده از آنزﱘ NcoI ﲢت برش قرار گرفتند. سپس قطعات بریده شده بر روي ژل آگارز %1 رانده شدند. در هنایت قطعه آلون شده به ﳘراه پراﳝرهاي p1 وp4 جهت تواﱄ یابی DNA به شرکت TAG-Copenhagen در کشور داﳕارک، ارسال گردید.
نتایج:
با استفاده از آزمون PCR قطعات α و β تکثﲑ شده و پس از رانده ﳏصولات PCR بر روي ژل آگارز، ﳘانطور آه در تصویر ﴰارة 1در ستوهناي 2 و 3 مشاهده می شود، تکثﲑ این قطعات به خوبی و بدون وجود هیچ باند اضافه اي اﳒام گردید. سپس این قطعات از ژل استخراج و به منظور تکثﲑ قطعه هنائی - ژن آاملEGFP حامل جهش - مورد استفاده قرار گرفتند. قطعه هنائی پس از تکثﲑ در ژل آگارز رانده شد - تصویر ﴰارة 1، ستون - 3 و ﳘانطور آه در مشاهده می شود از نظر طول آاملا مشاﲠه با ژن EGFP اولیه - تصویر ﴰارة 1، ستون - 3 می باشد. ستوهناي 2و 3 در تصویر ﴰارة 1 به ترتیب آنﱰل منفی براي ژن EGFP قبل و بعد از موتاسیون می باشند. پس از آلون ﳕودن ژن حاوي جهش درون سلول E.coli، این قطعه توسط آنزﱘ NcoI مورد برش قرار گرفت. نتیجه این بود آه ژنEGFP اولیه - فاقد موتاسیون - توسط آنزﱘ NcoI بریده شد وﱄ ژن EGFP حامل موتاسیون ، به صورت دست ﳔورده باقی ماند. در ادامه نیز با اﳒام عمل تواﱄ یابی DNA مشخص شد آه جهش A168T در ژن EGFP به وجود آمده و سایر مناطق این ژن دست ﳔورده باقی مانده اند. ﳕودار ﴰارة 1B ﲞشی از نتایج تواﱄ یابی را نشان می دهد، ﳏل جهش با علامت پیکان نشان داده شده است.
ﲝث:
از آﳒائی آه وجود جایگاه برش آنزﱘ NcoI بر روي ژن - GFPmut1 - EGFP باعث ﳏدودیت هائی در آاربرد آن می شد، تصمیم گرفته شد آه جایگاه برش این آنزﱘ با تکنیک Site directed mutagenesis حذف شود. با بررسیهاي به عمل آمده مشخص گردید آه تواﱄ هدف آنزﱘ NcoI، CCATGG می باشد و این تواﱄ به ترتیب در بردارندة رمز مربوط به اسیدآمینه هاي پرولﲔ - CCA - و تریپتوفان - TGG - می باشد. از آﳒائی آه تریپتوفان تنها با رمز TGG آد می شود و رمزهاي مربوط به پرولﲔ چهار آدون CCT، CCA، CCG و CCC می باشند، مشخص گردید آه تنها گزینه پیش رو جهت حذف ﳏل برش آنزﱘ NcoI بدون تغیﲑ در رمز مربوط به اسیدآمینه هاي ژن EGFP ، جاﲜائی باز سوم از آدون مربوط به اسیدآمینه پرولﲔ می باشد. بنابراین تصمیم شد آه رمز CCA به رمز CCT تغیﲑ داده شود، بدین منظور بر طبق روش - 2 - SOE پراﳝرهاي ﳘپوشانی طراحی شدند آه این جایگاه را در خود داشتند p3 - و . - p4 با اﳒام مراحل تکنیک SOE و آلون ﳕودن ژن حاوي موتاسیون A168T در E.coli ، این ژن تغیﲑ یافته با آنزﱘ NcoI ﲢت برش قرار گرفت، نتیجه حاصله آه عدم برش ژن EGFP بود نشان دهندة حذف این جایگاه از روي ژن EGFP می باشد. در هنایت نیز با اﳒام تواﱄ یابی این ژن، از حذف جایگاه NcoI از روي آن و عدم اﳚاد موتاسیون ها ناخواسته در سایر قسمتهاي آن اطمینان حاصل آمده است.
