بخشی از مقاله
تهيه نانوذرات آهن اصلاح شده به عنوان پايه اي براي تثبيت آنزيم ليپاز
چکيده
پيشرفت هاي اخير در فناوري نانو و ساخت انواع مختلف نانو ساختارها، کاربردهاي جديدي را در زيست فناوري بر پايه نانوسـاختارها فراهم آورده است . يکي از مهم ترين زمينه هاي ورود نانوساختارها به حوزه زيست فناوري ، استفاده از آن ها در پايدارسازي آنزيم هـا اسـت .
با وجود قابليت کاربردي فراوان آنزيم ها، عمر کوتاه و عدم پايداري آن ها کاربردشان را با محدوديت مواجه کرده اسـت . در ايـن مقالـه از نانو ذرات مغناطيسي Fe3O4 عامل دار شده در جهت تثبيت آنزيم ، استفاده شده است . نانوذرات مغناطيسي Fe3O4 به روش هـم رسـوبي توليد گرديد و سپس به ترتب با هيدروکسي آپاتيت ، پلي اتيلن ايمين و بتاسيکلودکسترين پوشـش داده شـد. بررسـي طيـف هـاي FTIR، XRD و TGA نشان مي دهد که نانوکامپوزيت هاي چندلايه مغناطيسي بطور صحيح تهيه شده است . همچنـين مرفولـوژي نـانوذرات بـا روش SEM مورد تأييد قرار گرفت . نانوکامپوزيت هاي چندلايه مغناطيسي سپس براي تثبيت آنزيم ليپاز مورد استفاده قرارگرفت .
واژه هاي کليدي : نانوذرات مغناطيسي ، اکسيد آهن ، اصلاح سطح ، آنزيم ليپاز، تثبيت آنزيمي
مقدمه
آنزيم ها، کاتاليست هاي زيستي با اندازه هايي در ابعاد نانومتر مي باشند که قابليت هاي کاربردي گسترده اي در عرصه هاي مختلف تحقيقاتي و صنعتي دارند. اختصاصي بودن آنزيم ها قابليت کاربردي فراواني براي آن ها ايجادکرده است ، اما غيرفعال شدن آن ها در مواجهه با شرايط مختلف محيطي بدليل داشتن ساختار پروتئيني حساس ، کاربرد اين مولکول هاي پراهميت را با محدوديت هاي بسيار جدي روبرو مي نمايد. بهبود پايداري آنزيم ها مي تواند کاربردهاي عملي آن ها را افزايش دهد [۱و۲]. استفاده از مواد نانوساختار براي پايدارسازي آنزيم ها، نه تنها سبب بهبود پايداري آن ها مي شود، بلکه ساير خواص آنزيم ها به عنوان يک سيستم نانوکاتاليست زيستي را نيز تقويت مي نمايد. از جمله اين خواص مي توان به بارگذاري بالاي آنزيم ها در چنين بسترهايي اشاره کرد. به علت نسبت سطح به حجم بسيار زياد نانوذرات ، مقدار بارگذاري آنزيم روي نانوذرات قابل ملاحظه است . استفاده از نانوذرات در پايدارسازي آنزيم همچنين محدوديت نفوذ سوبسترا به سطح آنزيم را برطرف مي سازد. با اتصال آنزيم بر نانوذرات مغناطيسي ، مي توان به وسيله يک آهن رباي خارجي آنزيم را از محيط واکنش خارج کرد و قابليت هايي مانند استفاده مجدد از آنزيم تثبيت شده را فراهم کرد [۳]. از جمله روش هاي پايدارسازي آنزيم ها، تثبيت آنزيم مي باشد. تثبيت آنزيم تجربه يک تحول مهم است . از نيمه دوم قرن بيستم تلاش هاي زيادي در جهت گسترش آنزيم هاي تثبيت شده غيرمحلول براي کاربرد در زمينه هاي گوناگون انجام گرفته است . از فوايد آنزيم تثبيت شده نسبت به آنزيم آزاد مي توان به استفاده دوباره از بيوکاتاليست هتروژن و کنترل فرآيند، جداسازي آسان از مخلوط واکنش ، کاهش ميزان آنزيم مصرفي به دليل استفاده مجدد از آن و در نتيجه کاهش هزينه ها، افزايش پايداري آنزيم و افزايش راندمان محصول نسبت به استفاده از آنزيم آزاد و بهينه شدن درصد محصول اشاره کرد. مهم ترين تکنيک در فرآيند تثبيت آنزيم ، انتخاب و تهيه يک پايه مناسب براي تثبيت آنزيم است [۴]. آنزيم ليپاز يکي از مهمترين بيوکاتاليست ها است که کاربرد گسترده اي در صنايع شيمييايي ، دارويي و پزشکي دارد. ليپاز وظيفه متابوليسم چربي ها و روغن ها به صورت احياء آن ها به اسيدهاي چرب آزاد و گليسرول را برعهده دارد.
سلول هاي باکتريايي ، قارچي ، گياهي و جانوري اين آنزيم را با ويژگي هاي متفاوت توليد مي کنند [۵]. در اين مقاله ، آنزيم ليپاز روي نانوذرات مغناطيسي Fe3O4 پوشش داده شده با هيدروکسي آپاتيت ، پلي اتيلن ايمين و بتاسيکلودکسترين تثبيت شده است .
بخش تجربي
آهن کلريد(II)، آهن کلريد(III)، کلسيم نيترات ، دي آمونيوم هيدروژن فسفات و آمونيوم هيدروکسيد از شرکت مرکِ آلمان خريداري شد. هگزا متيلن دي ايزوسيانات ، پلي اتيلن ايمين ، بتاسيکلودکسترين و پارا نيترو فنيل بوتيرات از شرکت سيگما آلدريچِ آمريکا خريداري شد. طيف مادون قرمز تبديل فوريه به وسيله دستگاه مدل Nicolet FT-IR 550 Magnaو آناليز گرماسنجي وزني به وسيله دستگاه مدل thermo gravimetric analyzer TGA Q50 و طيف پراش پرتو ايکس به وسيله دستگاه مدل XPert MPD advanced diffract meterتهيه شد.
تهيه نانوذرات و عامل دار کردن آن ها
نانوذرات مغناطيسي Fe3O4 با روش هم رسوبي در محيط به شدت قليايي تهيه شدند. ۴.۳۲ گرم از کلريد آهن شش آبه و۱.۶ گرم از کلريد آهن چهار آبه ، در ۱۰ ميلي ليتر آب ديونيزه حل شد و سپس تحت جو نيتروژن و توسط هم زن مکانيکي با دور بالا، به مدت ۳۰ دقيقه با هم مخلوط شدند. سپس در دماي ۷۰ درجه سانتي گراد و تحت شرايط هم زن مکانيکي با دور بالا و تحت جو نيتروژن ، ۲۵ ميلي ليتر محلول آمونيوم هيدروکسيد به اين محلول افزوده مي شود و بعد از اتمام محلول آمونيوم هيدروکسيد، اين محلول به مدت ۵ ساعت با هم زن مکانيکي با دور بالا و تحت جو نيتروژن هم زده مي شود و در نهايت ، به وسيله يک آهن رباي خارجي ، نانوذرات مغناطيسي Fe3O4 از محلول خارج مي شوند [۶].
سپس به يک گرم از اين نانو ذرات ، يک گرم پلي اتيلن ايمين افزوده شده و به مدت ۳ ساعت و در دماي ۹۰ درجه سانتي گراد توسط هم زن مکانيکي با دور بالا هم زده مي شود [۷]. در ادامه ،يک گرم ب اسيکلودکسترين به همراه هگزامتيلن دي ايزوسيانات به عنوان لينکر، در DMF خشک به نانو ذرات بالا افزوده مي گردد و به مدت ۳ ساعت در دماي ۷۰ درجه سانتي گراد هم زده مي شود و سپس توسط آهن ربا خارجي ، محلول روي نانوذرات خارج شده و نانوذرات با آب ديونيزه شسته مي شود [۸]. همچنين به منظور اتصال هيدروکسي آپاتيت ، پس از تهيه نانوذرات Fe3O4، ۵۰ ميلي ليتر محلول مائي ۳۳.۷ ميلي مولار از کلسيم نيترات و ۵۰ ميلي ليتر محلول مائي ۲۰ ميلي مولار از دي آمونيوم هيدروژن فسفات تهيه مي شود. سپس به يک گرم از نانوذرات Fe3O4 پخش شده در آب ديونيزه افزوده شده و به مدت دو ساعت در دماي ۹۰ درجه سانتي گراد توسط هم زن مکانيکي با دور بالا و تحت جو نيتروژن هم زده مي شود [۹]. مراحل اتصال پلي اتيلن ايمين و بتاسيکلودکسترين همانند توضيحات بالا، به روي نانوذرات Fe3O4 پوشش داده شده با هيدروکسي آپاتيت انجام مي شود. بدين ترتيب نانوذرات Fe3O4 به ترتيب پوشش داده شده با هيدروکسي آپاتيت و پلي اتيلن ايمين ، نانوذرات Fe3O4 به ترتيب پوشش داده شده با هيدروکسي آپاتيت و پلي اتيلن ايمين و بتاسيکلودکسترين ، نانوذرات Fe3O4 پوشش داده شده با پلي اتيلن ايمين و نانوذرات Fe3O4 به ترتيب پوشش داده شده با پلي اتيلن ايمين و بتاسيکلودکسترين براي تثبيت آنزيم ليپاز به کار برده شد.
تثبيت آنزيم
به منظور تثبيت آنزيم روي پايه هاي ذکر شده ، محلول آنزيم آزاد به پايه افزوده مي شود و در دماي ۲۵ در ه سانتي گراد در انکوباتورشيکردار قرار مي گيرد تا آنزيم و پايه در مجاورت يکديگر قرار گيرند و آنزيم به پايه متصل گردد. فعاليت آنزيم تثبيت شده ، نسبت به آنزيم آزاد و با استفاده از پارانيتروفنيل بوتيرات به عنوان سوبسترا توسط اسپکتروفوتومتر تعيين مي شود. بدين نحو که هرچه آنزيم فعاليت بيشتري داشته باشد، تأثير بيشتري بر پارانيتروفنيل بوتيرات دارد که غلظت محصول عملکرد آنزيم ليپاز بر سوبسترا افزايش مي يابد که با توجه به به غلظت مربوط مي شود [۴].̃
نتايج و بحث
از نانوذرات Fe3O4 عامل دار شده طيف FTIR تهيه شده است . همان طور که در شکل ۱ مشخص است ، درطيف FTIR مربوط به Fe3O4 خالص (طيف a از شکل ۱) پيک ١-cm ۵۸۶ مربوط به پيوند Fe-O و پيک ١-cm مربوط به پيوند OH مي باشد، درطيف FTIR مربوط به Fe3O4 پوشش داده شده با هيدروکسي آپاتيت (طيف b از شکل )، پيک محدوده ١-cm ۶۰۰ و cm ۱۱۰۰ معرف حضور گروه PO3 و پيک ١-cm ۳۴۲۰ معرف گروه هيدروکسيل مي باشد. حضور پلي اتيلن ايمين در سطح نانوذرات درطيف FTIR از طريق پيک ١-cm ۲۸۹۰ و ١-cm ۲۹۲۰ که معرف پيوند C-H و پيک محدوده ١-cm ۳۵۰۰-۳۳۰۰ مربوط به ارتعاش کششي N-H و محدوده ١-cm ۱۵۴۰ تا ۱۵۷۰ مربوط به ارتعاش خمشي N-H، تأييد مي گردد (طيف c,d از شکل ۱). ايجاد پيک محدوده ١-cm ۱۶۳۸-۱۶۳۰ که معرف آميد مي باشد، نشان دهنده تشکيل پيوند آميدي بين بتاسيکلودکسترين و گروه ايزوسيانات از هگزامتيلن دي ايزوسيانات در سطح نانوذرات مي باشد.
همچنين پيک محدوده ١-cm ۱۱۰۰-۱۰۷۵ معرف گروه C–O و پيک ١-cmمعرف گروه C–O–C و پيک cm
۳۳۰۰ مربوط به گروه هاي OH بتا سيکلودکسترين مي باشد (طيف e,f از شکل ۱).
