بخشی از مقاله
چکیده
اسید فسفاتازها گروهی از آنزیم ها هستند که هیدرولیز پیوند فسفو استري انواع مختلفی از سوبستراهاي فسفاته را در pH اسیدي کاتالیز می کنند.
گیاه آرابیداپسیس داراي تعداد زیادي ژن هاي رمزکننده اسید فسفاتازها می باشد. بررسی ها نشان داده است که علیرغم اهمیت نقش این ژن ها در حفظ هموستازي فسفات، بیان فراوان و یا جهش در ژن هاي مذکور منجر به تغییر فنوتیپی خاصی در گیاه در شرایط عادي و یا تحت تنش هاي محیطی نمی شود. به نظر می آید که بیان فراوران و یا ایجاد جهش در یک ژن توسط یک یا گروهی از ژن هاي فسفاتاز جبران می گردد.
به منظور بررسی این فرضیه، در پژوهش حاضر از خوشه بندي بیانی ژن ها در طول زمان با استفاده از الگوریتم FCM استفاده شد. با استفاده از لاین هاي خالص جهش یافته ژن هاي PAP7، PAP9، PAP17، PAP18، PAP21 و PAP26 مشخص شد که در بیشتر موارد بین اسید فسفاتازها رابطه جبرانی بین اعضاي هم خوشه وجود دارد، گرچه در این رابطه جبرانی هم خوشه بودن شرط لازم نیست. بررسی الگوي بیان زن هاي رمز کننده فسفاتازها در لاین هاي تراریخت با بیان فراوان ژن هاي PAP7، PAP17، PAP18 و PAP26 نیز این موضوع را تایید کرد.
مقدمه
فسفاتازها فسفو هیدرولاز هاي مونو استري - E.C.3.1.3 - هستند که بر اساس بهینه pH فعالیت به دو گروه آلکالین و اسید فسفاتاز تقسیم می گردند. اسید فسفاتازها - E.C.3.1.3.2 - آنزیم هایی هستند که در محدوده 4 pH تا هفت مونواسترهاي فسفات را هیدرولیز می کنند . - 1 - نقش فیزیولوژیکی این آنزیمها در سلول تاکنون بخوبی مشخص نشده است که بخشی از آن به علت تنوع اسید فسفاتازها و بخشی دیگر مربوط به تنوع سوبسترایی این آنزیم هاست 2 - ،. - 3 بعلاوه، رونوشت هاي ژن هاي اسید فسفاتاز در اندام هاي مختلف حضور دارند، همچنین بیان آن ها تحت شرایط محیطی و نموي از جمله تنش شوري و خشکی، حمله عوامل بیماریزا، جوانه زنی بذر و گلدهی 4 - ، 5، 2، 6 و - 7 بالا می رود.
در گیاه آرابیدوپسیس با استفاده از جستجوي بر مبناي شباهت و موتیف، 58 جایگاه رمز کننده براي اسید فسفاتازها یافت شد 8 - ، Faizi و همکاران داده هاي منتشر نشده - . همردیفی چندگانه توالی پروتئینی اسید فسفاتازها با استفاده از روش خوشه اي منجر به تقسیم بندي این گروه از پروتئین ها به پنج خانواده شد: اسید فسفاتازهاي بنفش - PAPs - ، فسفو لیپید فسفاتازها - PLPs - ، هیستیدین فسفاتازها - HAPs - ، فسفاتازهاي وابسته به - HRPs - HAD و فسفاتازهاي گروه . - SAPs - Survival در این میان اسید فسفاتازهاي بنفش بیشتر مورد مطالعه قرار گرفته اند. روشن شدن نقش و عملکرد اسید فسفاتازها در گیاه می تواند به روشن شدن دلایل وجود تعداد زیاد ژن هاي اسید فسفاتاز در گیاهان کمک کند. براي رسیدن به این هدف توضیح ویژگی هاي ساختاري، الگوي بیان، ارتباطات درون مولکولی و نشانویژگی هاي بیوشیمیایی این ژن ها ضروري است.
استفاده از جهش یافته هاي ژن هاي اسید فسفاتاز نیز می تواند به طور موثر به روشن شدن نقش آن ها و نیز اثبات وجود ارتباطات عملکردي و نحوه این ارتباط کمک کند. دسترسی به دودمان هاي جهش یافته با ورودي T- - T-DNA - DNA insertion lines منبع بسیار مهمی براي بررسی نحوه عمل و نقش اسید فسفاتازها هستند. همچنین ایجاد دودمانهاي با بیان بالاي ژنهاي جهش یافته و مقایسه آن با گیاهان جهش یافته به فهم عملکرد احتمالی فسفاتازها و نقش آن در هموستازي Pi کمک خواهد کرد.
در این پروژه ، برخی از ژن هاي فسفاتاز براي بررسی هاي دقیق تر انتخاب شدند تا با بررسی دودمان هاي جهش یافته و نیز تولید دودمان هاي با بیان بالاي آن ها نقش این ژن ها در تامین Pi در ارتباط با سایر اسید فسفاتازها صورت گیرد.
مواد و روش ها
شناسایی ژن هاي رمزکننده اسید فسفاتاز و یافتن توالی هاي یگانه هر ژن: توالی ژن هاي اسید فسفاتاز گیاه آرابیدوپسیس از طریق پایگاه - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview - Map Viewer بدست آمد. جهت مشخص کردن توالیهاي یگانه ژن هاي اسید فسفاتاز گیاه آرابیدوپسیس از نرم افزاري که در طول انجام پروژه طراحی شده بود استفاده شد.
شناسایی لاینهاي جهش یافته حاوي - T-DNA insertion lines - T-DNA و شناسایی لاین هاي هموزیگوس جهش یافته: لاین هاي جهش یافته براي ژن هاي PAP7، PAP9، PAP17، PAP18، PAP21 و PAP26 از بانک بذر آرابیدوپسیس و از طریق پایگاه اینترنتی - http://abrc.osu.edu - تهیه شد. براي یافتن اولادهاي هموزیگوت، گیاهان جهش یافته با روش PCR و استفاده همزمان از سه آغازگر، یکی مربوط به مرز چپ T-DNA و یک جفت آغازگر اختصاصی در هر ژن مورد بررسی قرار گرفتند. سپس به منظور تایید عدم ابراز ژن هاي مورد بررسی در لاین هاي جهش یافته آزمون RT-PCR نیمه کمی انجام شد.
تهیه دودمان هاي با بیان بالاي برخی از ژن هاي اسید فسفاتاز: توالی cDNA ژن هاي PAP7، PAP17 پس از تکثیر در ناقل گیاهی - 9 - pARM2 همسانه سازي شد. همچنین ژن هاي PAP18 و PAP26 به ترتیب در ناقل هاي pARM1 وpAMQB31 همسانه سازي شد 9 - ، . - 10 سازه هاي مذکور پس از انتقال به آگروباکتریوم تومه فاشینس سوش GV3101 از طریق روش تراریختی In Planta به گیاه آرابیدوپسیس منتقل شدند
کشت گیاه و بررسی بیان ژن ها در طول زمان در محیط کشت داراي فسفات و بدون فسفات: براي کشت گیاهان در بررسی هاي سري زمانی از روش Malboobi و همکاران 1997 استفاده شد . - 12 - براي نمونه برداري زمان بندي شده، گیاهان 14 روزه رشد یافته در محیط کشت MS مایع با نصف مقادیر درشت مغذي ها به محیط کشت بدون فسفات یا داراي 5 میلی مولار فسفات انتقال یافتند و پس از مدت 3، 7، 14 و 21 روز از تیمار بافت هاي ریشه و اندام هوایی گیاهان تحت تیمار برداشت شدند.
بررسی بیان ژنها با استفاده از روش لکهگذاري نورترن معکوس : - Reverse Northern Blotting - به منظور بررسی وجود رابطه جبرانی بین اسید فسفاتازها از روش لکه گذاري معکوس نورترن مطابق با روش Lohrasebi و همکاران - 2007 - با اندکی تغییرات استفاده شد
بررسی بیان ژن ها با استفاده از RT-PCR نیمه کمی: پس از استخراج RNA و سنتز cDNA، الگوي بیان ژن هاي اسید فسفاتاز در طول زمان در حضور و عدم حضور فسفات با استفاده از آغازگرهاي مربوط به منطقه منحصر به فرد هر ژن و روش PCR انجام شد. پس از انجام واکنش PCR و راندن نمونه بر روي ژل آگارز، ژل ها با استفاده از دستگاه تایفون - Pharmacia - اسکن شدند. تصاویر حاصل پس از ذخیره شدن توسط نرم افزارهاي TotalLab مورد بررسی قرار گرفت و شدت بیان هر ژن نسبت به بیان ژن آلفا توبولین بدست آمد.
لازم به ذکر است که اثبات عدم بیان ژن هاي مورد مطالعه در لاین هاي جهش یافته در مقایسه با لاین وحشی نیز با استفاده از این روش مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج و بحث
در بررسیهاي انجام شده بر روي ریشه گیاهان تحت تیمار فقدان فسفات به مدت 14 روز مشخص شد که جهش در ژن PAP7 در مقایسه با گیاه طبیعی منجر به افزایش بیان ژنهاي اسید فسفاتاز PAP21 ، PAP22 و PLP8 شده است. در مقابل، با افزایش بیان ژن PAP7 کاهش بیان ژنهاي مذکور مشاهده میشود. از طرفی بیان زیاد ژن PAP7 منجر به کاهش بیان ژن PAP5 در مقایسه با هر دو گیاه جهش یافته و طبیعی نیز شده است. لازم به ذکر است که بررسیهاي انجام شده، میانگین تغییرات بیان فراوان ژنPAP7 در دو لاین تراریخت متفاوت است گرچه از نظر ظاهري تفاوتی با گیاهان جهش یافته و طبیعی نداشتند - شکل . - 1A بررسی گلوبال الگوي بیان ژن هاي رمزکننده فسفاتازها نیز نشان داده شده بود که ژن هاي PAP7، PAP22 و PAP5 با همدیگر در یک خوشه قرار می گیرند. در صورتی که ژن PLP8 در خوشه 1 قرار داشته و بیشترین میزان بیان این ژن در تیمارهاي 3 تا هفت روزه مشاهده می شود.
بررسی تاثیر جهش در ژن PAP18 در ریشه گیاهان جهش یافته و وحشی تحت تیمار 3 روزه فقدان فسفات نشان داد که عدم حضور این ژن باعث کاهش معنی داري در بیان PAP12 و کاهش جزئی بر بیان ژن هاي HRP6، PAP4، PAP28، PAP13 و PAP23 در گیاه جهش یافته هموزیگوس شده است. همچنین، بیان بالاي این ژن منجر به افزایش بیان ژن HRP11 می گردد. از طرفی جهش در ژن PAP18 منجر به عدم بیان ژن PAP8 می گردد حال آنکه در گیاه طبیعی و لاین تراریخت با بیان بالا ژن نامبرده داراي بیان است - شکل . - 1C بررسی الگوي بیان ژن هاي رمزکننده فسفاتازها و خوشه بندي آن ها در تیمار مزبور نیز نشان داد که ژنهاي PAP18 با ژنهاي PAP23، PAP12، HRP6، PAP13-2 و PLP1 هم خوشه هستند. در حالی که، ژن HRP11 در خوشه دیگري قرار داشته و داراي حداکثر بیان پس از تغذیه مجدد 3 ساعته در تیمار سه روزه تنش فسفات است.
بررسی بر روي ریشه گیاهان تحت تیمار 14 روزه تنش فسفات نشان داد که افزایش بیان ژن PAP26 در گیاه تراریخت آرابیدوپسیس منجر به افزایش بیان ژنهاي HRP1، HRP7، HRP8، HRP9، HRP12، PAP2، PAP10 و PAP7 می گردد. در حالی که در گیاه جهش یافته هموزیگوس در همان بافت علاوه بر کاهش بیان ژن هاي فوق بیان ژن PAP4 نیز کاهش یافته است. از طرفی جهش در ژن PAP26 منجر به افزایش بیان ژن PLP9 نیز منجر میشود
بررسی گلوبال الگوي بیانی ژن هاي رمزکننده فسفاتازها و خوشه بندي ژن ها بر اساس این الگو در تیمارهاي سري زمانی غلظت صفر میلی مولار فسفات در ریشه نشان داده بود که ژن PAP26 با ژن هاي PAP25، HRP10-1 و PAP17 هم خوشه بوده در صورتی که ژنهاي افزایش بیان یافته در نتیجه عدم بیان ژن PAP26 به خوشههاي دیگر تعلق دارند. تنها ژنی که با ژن PAP26 هم خوشه بوده و در نمونه جهش یافته PAP26 افزایش بیان معنیداري را نشان داده است، ژن PAP17 میباشد. این دو ژن از نظر محل استقرار پروتئین حاصل و نیز ویژگیهاي آنزیمی بسیار شبیه بوده هم فعالیت پراکسیدازي و هم فعالیت فسفاتازي دارند.
