بخشی از مقاله
چکیده
گیاه داراي مکانیسمهاي متنوعی براي تحمل تنش شوري است. یکی از این روشها، دفع یونهاي سمی بخصوص یون سدیم از درون سلول به محیط خارج از آن و یا به درون واکوئلها، از طریق پروتئین هاي ویژهاي بنام آنتی پورتر است. آنتی پورتر AtNHX1 در تونوپلاست گیاه آرابیدوپسیس تالیانا باعث تبادل یون سدیم در ازاء یون هیدروژن میشود براي جداسازي ژن کدکننده آنتی پورتر AtNHX1، بذور آرابیدوپسیس تالیانا واریته کلمبیا در محیط MS کشت شدند.
به منظور افزایش بیان ژن، گیاهان رشد یافته به مدت 4 تا 5 ساعت با کلرید سدیم 400 میلی مولار تیمار شدند. سپس RNA کل از گیاه استخراج شد. با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی که داراي توالی برشی در انتهاي5 ́ آغازگر برگشتی و توالی برشی XhoΙ در انتهاي5 ́ آغازگر پیشرو بودند، ساخته شد و توسط PCR تکثیر گردید. محصول PCR در پلاسمید درج و باکتريهاي مستعد سویه توسط پلاسمیدهاي حاوي قطعه درج شده، نوترکیب شدند. پلاسمید مورد نظر دوباره استخراج گردید و پس از هضم توسط آنزیمهاي برشی، قطعه مورد نظر از آن به دست آمد.
واژههاي کلیدي: شوري، همسانهسازي ژن، آنتی پورتر، آرابیدوپسیس تالیانا
مقدمه
تنش شوري یکی از عوامل محدود کننده رشد و نمو و کاهش دهنده محصولات گیاهی بشمار میآید. بعلاوه باعث استفاده بیشتر از بذر، کودهاي آلی و شیمیایی و نیاز بیشتر به آبیاري و زهکشی شده و بدین ترتیب باعث افزایش هزینه تولید میگردد. با توجه به شور بودن درصد قابل توجهاي از اراضی دنیا و اینکه در ایران نیز بیش از نیمی از زمینهاي قابل کشت تحت تأثیر شوري است - - 1، اهمیت تلاش در جهت افزایش تحمل گیاه به تنش شوري به خوبی نمایان میگردد.
براي مقابله با تنش شوري در سطح سلول گیاهی انجام سه فرآیند سمیتزدایی، هومئوستازي و رشد و نمو مجدد ضروري است محصول ژنهایی که بیان آنها در اثر تنش شوري افزایش مییابد غالباً در ساخت محافظت کنندههاي اسمزي و چپرونهاي ملکولی و بازدارندگی بر روي آنزیمهاي دخیل در پاسخهاي اکسیداتیو نقش دارند. بر این اساس گیاهان یونجه، تنباکو و برنج مقاوم به شوري به دست آمدهاند که به ترتیب با انتقال ژنهاي سوپر اکسید دیسموتاز، گلوتاتیون -sترانسفراز گلوتاتیون پراکسیداز و HVA1 ترایخت شده بودند.
از آنجا که اولین قدم براي انتقال ژنهاي القاء کننده مقاومت به تنش به گیاه و در نتیجه تولید گیاهان تراریخته مقاوم، جداسازي و همسانهسازي ژنهاي مورد نظر در ناقل مناسب است نسبت به جداسازي ژن کدکننده آنتیپورتر AtNHX1 از گیاه آرابیدوپسیس تالیانا و همسانهسازي آن در باکتري E. coli مبادرت گردید. تاکنون ژنهاي متعددي در ارتباط با القاء مقاومت به تنش شوري از گیاه آرابیدوپسیس تالیانا همسانهسازي شدهاند که از آن جمله میتوان به ژنهاي CAX1 و CAX2 اشاره نمود که در انتقال یون کلسیم دخالت دارند.
همچنین با همسانهسازي این ژن میتوان نسبت به شناسایی سایر ژنهاي مشابه در گونههاي نزدیک با استفاده از نواحی حفاظت شده و تعیین میزان همولوژي آنها اقدام نمود. مزایاي گیاه آرابید و پسیس تالیانا شامل اندازه ژنومی مناسب، اندازه کوچک و نیازهاي رشدي کم، چرخه زندگی کوتاه و توانایی رشد مطلوب در شرایط کنترل شده موجب شد تا ما در این تحقیق از آن استفاده نماییم.
مواد و روشها
به منظور یکنواختی در جوانهزنی، بذور مرطوب شده گیاه آرابیدوپسیس تالیانا به مدت یک هفته در دماي 4˚c قرار گرفتند و پس از ضدعفونی، در محیط MS با دماي 23 درجه سانتیگراد و تناوب نوري 8 ساعت روشنایی، 16 ساعت تاریکی کشت شدند. به منظور افزایش بیان ژن، گیاهان رشد یافته با کلرید سدیم 400 میلی مولار تیمار شدند سپس RNA کل به روش چامزینسکی از برگهاي گیاه استخراج گردید. براي بررسی کیفیت RNA استخراج شده از الکتروفورز ژل آگارز یک درصد استفاده شد. بر مبناي مطالعه ترادف ژن در بانک اطلاعاتی NCBI، پرایمر اختصاصی پیشرو با توالی و پرایمر اختصاصی برگشتی با توالی طراحی گردید. پرایمر پیشرو داراي توالی برشی مربوط به آنزیم XhoI در انتهاي5 ́ است که دو نوکلئوتید - CA - به دو طرف سایت برش اضافه شده است.
از سوي دیگر توالی برشی مربوط به آنزیم به انتهاي5́ توالی پرایمر برگشتی اضافه شد و دو نوکلئوتید - AT - نیز قبل از آن قرار گرفت. براي ساخت رشته اول از آنزیم - شرکت فرمنتاز - استفاده شد. 10 میکروگرم به همراه پرایمر برگشتی، بافر و آنزیم RT به ترتیب با غلظت نهایی 1 میکرو مولار، 1 X، 1 میلیمولار، با آب دوبار تقطیر استریل به حجم نهایی رسانده شد. بطوریکه ابتدا آب مقطر استریل، RNA و پرایمر برگشتی به مقادیر ذکر شده در یک ویال ریخته شد و به مدت 10 دقیقه در دماي 70˚c گذاشته شد. سایر مواد به ویال اضافه گردید و به مدت 60 دقیقه در دماي 37˚c گذاشته شد تا رشته اول ساخته شود. سپس به مدت 12 دقیقه در دماي 50˚c قرار داده شد تا آنزیم غیر فعال شود.
از آنزیم براي انجام PCR استفاده گردید. 50 نانوگرم cDNA به همراه پرایمر پیشرو، پرایمر برگشتی، بافر10Xو آنزیم.Pfu به ترتیب با غلظت نهایی ، در یک ویال ریخته شد. پروفیل دمایی PCR عبارت بود از: واسرشت سازي اولیه در دماي 94˚c به مدت 4 دقیقه، 30 دوره تکثیر شامل واسرشتگی به مدت 30 ثانیه در دماي 94˚c، جفت شوندگی به مدت 2 دقیقه در دماي 60˚c و طویلسازي در دماي 72˚c به مدت 4 دقیقه و 30 ثانیه. در نهایت طویلسازي در دماي 72˚c به مدت 5 دقیقه انجام شد.
پس از هضم قطعه حاصل از PCR و پلاسمید توسط آنزیمهاي NotI و XhoI ، محصول PCR توسط آنزیم لیگاز در ناحیه MCS پلاسمید درج گردید سپس باکتري مستعد E. coli سویه با استفاده از کلسیم کلراید تهیه گردید. باکتري هاي مستعد با پلاسمید حاوي قطعه مورد نظر تراریخت شدند. بطوریکه در دو ویال جداگانه، در یکی پلاسمید داراي قطعه درج شده و در دیگري پلاسمید فاقد قطعه حاصل از PCR اضافه گردید و 30 دقیقه در روي یخ نگهداري شد. به مدت دو دقیقه در دماي 42 درجه سانتیگراد درون بن ماري شوك حرارتی داده شد. به مدت 10 دقیقه روي یخ گذاشته شد.
مقدار 1cc محیط کشت LB اضافه شد و یک ساعت در دماي 37˚c قرار داده شد. باکتري در دور 7500rpm به مدت 30 ثانیه رسوب داده شد. سوپرناتانت حذف شده و مقداري از آن که در ویال باقیمانده بود براي حل کردن رسوب استفاده گردید. در طی شب در محیط داراي آنتی بیوتیک آمپیسیلین با دماي 37˚c کشت شد. براي شناسایی باکتريهاي نوترکیب از استفاده گردید. به طوریکه سطح هر پتري میکرولیتر میکرولیتر آغشته شده بود.
کلنی باکتريهایی که قطعه خارجی در پلاسمید آنها درج شده بود به دلیل عدم فعال بودن محصول ژن LacZ، سفید رنگ بوده ولی کلنی باکتريهاي غیر نوترکیب به رنگ آبی دیده میشود. به منظور بررسی وجود قطعه مورد نظر، پلاسمید استخراج شده از کلنیهاي سفید با استفاده از آنزیمهاي NotI و XhoI مورد هضم قرار گرفت.
بحث
استخراج RNA کل با استفاده از روش چامزینسکی نتایج خوبی در پی داشت. البته بعضاً حل کردن رسوب حاصل به سختی امکان پذیر بود که در این صورت تجربه نشان داد چنانچه الکل بطور کامل از رسوب حذف شود، حل شدن رسوب تسهیل میگردد. عدم وجود نمک و خلوص RNA نیز به حل شدن آن کمک میکند. با توجه به تعداد نوکلئوتیدهاي اختصاصی در توالی پرایمرهاي مورد استفاده در این تحقیق 20 - نوکلئوتید براي رشته پیشرو و 17 نوکلئوتید براي رشته برگشتی - ، عملاً تنها یک توالی مکمل با پرایمرهاي مورد نظر قابل انتظار بود که نتایج حاصل نیز آن را تأیید نمود.
همچنین درصد GC براي پرایمر پیشرو برابر 46/7 و براي پرایمر برگشتی برابر 51/8 تعیین شد که از مقدار مناسبی برخوردار میباشد. براي کاهش بروز خطا در تولید محصول مورد نظر، از آنزیم Pfu. پلیمراز به جاي آنزیم پلیمراز استفاده شد. مزایاي پلاسمید بعنوان ناقل همسانهسازي شامل دارا بودن ناحیه MCS گسترده با 21 سایت برش براي آنزیمهاي محدودکننده، وجود ناحیه کدکننده LacZ ، القاء مقاومت به آنتیبیوتیک آمپیسیلین و اندازه مناسب باعث شد تا از آن براي درج محصول PCR استفاده گردد.
نتیجه گیري
الکتروفورز محصول PCR و رنگ آمیزي ژل با استفاده از اتیدیوم بروماید تنها یک باند را به طول تقریبی 1600bp بر روي ژل نشان داد که با توجه به اختصاصی بودن پرایمرها جهت تکثیر قطعه مورد نظر قابل انتظار میباشد رنگ آمیزي پلاسمیدهاي استخراج شده به روش لیز قلیایی، وجود سه باند تفکیک یافته را بر روي ژل آگارز یک درصد نمایان ساخت. وجود چندین باند به دلیل وجود حالت سوپرکویل در پلاسمید است که در اثر هضم پلاسمید و خطی شدن آن تنها یک باند باید بر روي ژل دیده شود که نتایج حاصل نیز آن را تأیید نمود.
