بخشی از مقاله
چکیده
GTP سیکلوهیدرولاز I از طریق مجموعهای از واکنشها، تبدیل GTP به دیهیدرونئوپترین تریفسفات و فوماریک اسید را کاتالیز میکند. این واکنش اولین مرحله در بیوسنتز تتراهیدروفولات - FH4 - در گیاهان و میکروارگانیسمهای مشخص و تتراهیدروبیوپترین - BH4 - در پستانداران میباشد. توالی cDNA کامل کدکننده GTP سیکلو هیدرولاز I تحت عنوان VvGTPCHI از بافت حبه انگور عسکری - Vitis vinifera L. cv. Askari - با استفاده از تکنیک واکنش زنجیرهای پلیمراز نسخهبرداری معکوس - RT-PCR - جداسازی و همسانهسازی شد.
توالی نوکلئوتیدی شامل 1338 نوکلئوتید میباشد که پروتئینی با 445 آمینواسید را کد میکند. پروتئین کد شده دارای وزن مولکولی 48/74 کیلو دالتون و نقطه ایزوالکتریک 6/75 میباشد. بررسی بیان این ژن به روش RT-PCR نیمه کمی نشان داد که این ژن در تمام بافتهای گیاهی بیان شده و همچنین تحت تنشهای غیر زنده با کاهش یا افزایش بیان مواجه گردید. بررسیها نشان داد که بیان این ژن تحت تنشهای H2O2 و CuSo4 افزایش یافته در حالی که در مواجه با سایر تنشهای غیر زنده شامل فلزات سنگین و هورمونهای گیاهی با کاهش بیان روبرو شد.
مقدمه
GTP سیکلوهیدرولاز I از طریق مجموعهای از واکنشها، تبدیل GTP به دیهیدرونئوپترین تریفسفات و فوماریک اسید را کاتالیز میکند. این واکنش اولین مرحله در بیوسنتز تتراهیدروفولات - FH4 - در گیاهان و میکروارگانیسمهای مشخص و تتراهیدروبیوپترین - BH4 - در پستانداران میباشد. FH4 به عنوان یک کوآنزیم عمل نموده و برای تعدادی از واکنشهای انتقالی تک کربنه مورد استفاده قرار میگیرد.
BH4 نیز به عنوان یک کوفاکتور احیاء کننده ضروری عمل می-کند . - He et al., 2004; Pelltier and Ziegler , 2001 - فولات یک مولکول سه قسمتی شامل پتریدین، پارا آمینو بنزوئیک اسید و یک گلوتامات می باشد. بخش پارا آمینو بنزوئیک اسید مرکزی از طریق گروههای کربوکسیل خود به یک یا چند بنیان گلوتامات متصل شده و حلقه پتریدین به گروه آمینو پارا آمینو بنزوئیک اسید متصل میشود
Hanson and در گیاهان پتریدین در سیتوزول و پارا امینو بنزوئیک اسید در پلاستید ها تولید میشود. سپس این بلوکها در میتوکندی به یکدیگر متصل شده و دی هیدرو پتروآت - DHP - را تشکیل میدهند که در نهایت با گلوتامیله شدن این مولکول، فولاتها سنتز میشوند . - Garratt et al., 2005; Scott et al., 2000 - آنزیم GTP سیکلوهیدرولاز I با تبدیل GTP به اسید فرمیک و دی هیدرونئوپترین اولین مرحله در تولید تتراهیدروفولات در گیاهان را کاتالیز میکند. در مهندسی متابولیک برای افزایش سنتز فولات بیشتر بر روی ژن GTP سیکلوهیدرولاز I هدفگذاری می شود
مواد و روشها
قلمههای یکساله از مزارع انگور در مرکز تحقیقات انگور تاکستان، قزوین، جمعآوری شده و درون گلدان کاشته شدند. به منظور اعمال تنشهای غیر زنده، 3 تا 4 برگ جوان از قلمههای یکساله جدا شده و به قطعات کوچک با قطر 1 سانتی-متری بریده شدند. پس از فیلتراسیون در معرض خلاء با استفاده از آب مقطر، قطعات برگی درون محلولهای تنشزا قرار داده شدند. این محلولها عبارت بودند از: 10 mM H2O2، 1mM diamide، 100 ʽM CuSO4، 100 ʽM CoCl2، 100 ʽM CdCl2، 100 ʽM AlCl3، 100 ʽM ABA و .100 ʽM SA پس از اعمال تنشهای غیر زنده، بافتهای برگی در دمای -80 C تا زمان استخراج RNA کل نگهداری شدند. RNA کل با روش توضیح داده شده توسط حیدری و همکاران - 2011 - استخراج گردید.
پس از سنتز رشته اول cDNA، واکنش RT-PCR با استفاده از آغازگرهای اولیگونوکلئوتیدی طراحی شده بر اساس توالیهای تظاهر یافته برچسبدار انجام شد - آغازگر رفت: 5'-ATGGGCGTCTTGGACGACG-3' ، آغازگر برگشت: . - 5'-TCAAGAAGTTGGAGAGTGTTTTGAA-3' شرایط دمایی و زمانی هر چرخه واکنش RT-PCRعبارت بود از: مرحله واسرشتگی اولیه - 94 C- 3min - ، 35 چرخه ]مرحله واسرشتگی - 94 C-30s - ،مرحله اتصال - 58 C-1min - و مرحله تکثیر [ - 72 C-1 min - و مرحله تکثیر نهایی .
- 72 C-10 min - محصول RT-PCR درون ناقل پلاسمیدی pTG19T - Vivantis - همسانهسازی شده و پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از تکنیک شوک حرارتی به درون سلولهای مستعد اشریشیاکلی سویه DH5، انتقال داده شدند. بیان ژن VvGTPCHI در بافتهای مختلف و تحت شرایط تنش غیر زنده با استفاده از تکنیک RT-PCR نیمه کمی مورد بررسی قرار گرفت. به عنوان شاهد درونی، آغازگرهای اختصاصی ژن اکتین از آرابیدوپسیس - ژن Atact2 با شماره دستیابی AF485783 از پایگاه توالی نوکلئوتیدی - NCBI GenBank نیز مورد استفاده قرار گرفتند. واکنش PCR در 35 چرخه دمایی- زمانی طبق شرایط فوق انجام شد.
