بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه: لیشمانیوز احشایی شدیدترین نوع بیماري سیستمیک در مقایسه با دیگر انواع آن محسوب می شود. واکسیناسیون هاي متعددي برعلیه این بیماري ارزیابی شده اند، ولی تا کنون هیچ یک حفاظت کامل را فراهم نکرده اند. واکسن زنده می تواند همانند عفونت طبیعی سیستم ایمنی را برانگیزد، و بدن را در برابر فهرستی غنی از آنتی ژن ها مانند انگل وحشی - - wild قرار دهد و به دنبال یک دوره طولانی، منجر به یک ایمنی قوي و پایدارتر می شود. در بین گونه هاي مختلف لیشمانیا، Leishmania tarentolae یک انگل جدا شده ازمارمولک - - lizard بوده که براي انسان غیرپاتوژن است و می تواند به عنوان یک واکسن زنده برعلیه لیشمانیازیز استفاده شود. هدف: در این مطالعه، در ادامه نتایج امید بخش و در جهت یک استراتژي جدید و کارا براي تهیه واکسن برعلیه لیشمانیوز احشایی، ترکیبات ویرولانت و ایمنوژنیک L. infantum A2/CPA/CPB-CTE، مورد بررسی قرار گرفته اند.
روش: پس از تهیه ژن فیوژن A2-CPA-CPB-CTE، کلونینگ آن در وکتور بیانیpEGFP-N3، به منظور بررسی بیان پروتئین در سلول هاي یوکاریوتیCOS-7 با استفاده از 3 روش RT-PCR، میکروسکپ فلورسنت و فلوسیتومتري، انجام شد. در ادامه یک L. tarentolae پایدار حامل این ژن فیوژن بوسیله تکنیک نوترکیبی همولوگ ، تهیه و از طریق 3 روش southern blotting، RT-PCR و western blotting تأیید گردید. نتیجه تحقیق: نتایج بدست آمده حاکی از آنست که پروتئین A2-CPA-CPB-CTE به میزان قابل توجهی در سیستم بیان یوکاریوتی COS-7 و انگل نوترکیب بیان و تأیید می شود. در مطالعات بعدي در نظر داریم تا از این انگل ترانس ژن پایدار به عنوان واکسن زنده بر علیه L.infantum، در مدل همستر بهره مند گردیم.
لغات کلیدي:لیشمانیوز احشایی، واکسن زنده لیشمانیا تارنتولی، ژن فیوژن A2-CPA-CPB-CTE، سیستم بیان یوکاریوتی COS-7
مقدمه
سازمان بهداشت جهانی لیشمانیوز را به عنوان یک مشکل بزرگ بهداشتی در کشورهاي در حال توسعه گزارش نموده استاخیراً.بیش از 12 میلیون نفر در 88 کشور به این بیماري مبتلا شده اند.[5] لیشمانیوز احشایی شدیدترین نوع بیماري سیستمیک در مقایسه با دیگرانواع آن - پوستی و مخاطی - محسوب می شود و پانصد هزار نفر را سالیانه تحت تأثیر قرار می دهد .[18]تاکنون اعتقاد بر این بوده است که بهترین استراتژي براي واکسیناسیون بر علیه این بیماري، القاء پاسخهاي قوي Th1 می باشد. روشهاي متعددي براي این منظور ارزیابی شده اند، ولی آنها حفاظت کامل ایجاد نکرده و یا نیاز به ادجوانت هاي غیر قابل قبول جهت القاء پاسخ مناسب Th1 در انسان دارند 9]و.[16 واکسن هاي زنده می توانند همانند عفونت طبیعی سیستم ایمنی را برانگیزند، و بدن را در برابر فهرستی غنی از آنتی ژن ها مانند انگل وحشی - wild - قرار دهد و به دنبال یک دوره طولانی، منجر به یک ایمنی قوي و پایدارتر می شود.
لذا ثابت شده است که استفاده از ارگانیسم هاي غیرویرولانت به عنوان واکسن، مؤثرتر از واکسن هايsubunit است 12]و.[17در بین گونه هاي مختلف لیشمانیا، Leishmania tarentolae یک انگل جدا شده ازمارمولک - - lizard می باشد. این انگل می تواند به اشکال آماستیگوت متمایز شده ولی قادر به زنده ماندن براي مدت طولانی در ماکروفاژهاي پستانداران نبوده و هرگز درهیچ یک از آلودگی هاي لیشمانیایی در انسان مشاهده نشده است و می تواند به عنوان یک واکسن زنده برعلیه L. donovani به علت توانایی اش در هدف گیري مناسب سلولهاي عرضه کننده آنتی ژن، القاء بلوغ سلولهاي دندرتیک و به کارگیري یک پاسخ ایمنی Th1 حفاظت بخش، عمل نماید .[2]از میان بعضی فاکتورهاي ویرولانس مهم، A2 اولین بار در L. donovani به صورت یک خانواده ژنی شناخته شد که تنها در فرم آماستیگوت بیان می شود .[3]
پروتئین هايA2اساساًتوالی هاي تکراري 10 آمینو اسیدي را با محدوده وزنی 45 تا kDa 110 - با توجه به تعداد تکرارها - ، شامل می شوند .[19] آنتی بادیهاي اختصاصی A2 در %90 نمونه هاي سرم از بیماران VL شناسایی شده اند، که تأییدي بر بیان آن در میزبان انسان می باشد .[6] بعلاوه استفاده از A2 به عنوان یک پروتئین نوترکیب یا یک DNA واکسن در موش BALB/c یااخیراًدر سگ ها، ایمنی قابل توجهی را برعلیه عفونت هاي L. donovani و L.amazonensi مربوط به هردو پاسخ هاي ایمنی همورال و سلولی ایجاد کرده است 4]و.[7 همچنیناخیراً L. tarentolae نوترکیب بیان کننده پروتئین A2 را به عنوان واکسن زنده برعلیه عفونت L. infantum طراحی کرده و در موش BALB/c مورد آزمایش قرار داده ایم، این واکسن کارایی خوبی را به عنوان یک واکسن مؤثر زنده برعلیه عفونت L. infantum دارد .[8]
سیستئین پروتئینازها - CPs - آنزیم هایی از خانواده پاپائین بوده و در انگل پروتوزوآي لیشمانیا، مطالعات وسیعی نشان می دهد که در حیات انگل، تکثیر و ایجاد بیماري نقش دارند و به عنوان دارو و یا اهداف واکسن براي کنترل لیشمانیوز مد نظر قرار گرفته اند. در مطالعات قبلی نشان داده شده است که سیستئین پروتئینازها، Type I - CPA - و Type II - CPB - در L. major به صورت پروتئین هاي نوترکیب در ساختار DNAیی، حفاظت نسبی بر علیه عفونت با این انگل در موش BALB/c ایجاد کرده اند .[1] همچنین سیستئین پروتئینازهاي L. infantum بسیار ایمنوژنیک بوده و می توانند حفاظت قابل توجهی را در مقابل چالش با این انگل در موش BALB/cایجاد کنند. واکسیناسیون DNAیی CPB زمانیکه با CPA ترکیب می شود، هم در عفونت L. major و هم L. infantumنتایج و سطح حفاظت بهتري را ایجاد می کند 1]،11و. [14
همچنین مشخص شده است که C-terminal extension - CTE - از CPB که در فرار از سیستم ایمنی نقش دارد، براي فعالیت آنزیمی ضروري نیست، به طوریکه پروتئینازهایی که فاقد این ناحیه هستند، فعال می باشندCTE .[13] به میزان بالایی ایمنوژنیک بوده ولی حفاظتی نیست و براي هدایت سیستم ایمنی به سمت Th2 مطلوبتر است. در حقیقت با حذف CTE، وجود ایمنی بالقوه CPB فاقد CTE علیه لیشمانیوز نشان داده شده است .[15]بنابراین در این مطالعه CPB فاقد - CPB-CTE - CTE را با ژنهاي A2 و CPA ترکیب کرده و بیان آن را در سیستم بیان یوکاریوتی COS-7، به صورت in vitro مورد ارزیابی قرار داده ایم. سپس واکسن زنده L. tarentolae حاوي ژن A2-CPA-CPB-CTE را طراحی و تأیید نموده ایم. در آینده در نظر داریم از آن به عنوان یک واکسن زنده مؤثر در برابر عفونت لیشمانیوز احشایی در مدل همستر استفاده کنیم.
مواد و روش ها
1.کلونینگ :
1.1.کلونینگ ژن فیوژن A2-CPA-CPB-CTE داخل وکتور بیانی pEGFP-N3
ژن فیوژن A2-CPA-CPB-CTE تأیید شده در وکتور کلونینگ pGEM-7zf - + - با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیم هاي EcoRI و BamHI، در وکتور بیان یوکاریوتیpEGFP-N3 کلون شد و توسط هضم آنزیمی تأیید گردید.
.1.2 کلونینگ ژن فیوژن A2-CPA-CPB CTE-GFP داخل وکتور بیان لیشمانیا pLEXSY
وکتور بیانpLEXSY ، یک وکتور Integrative بوده که به ما این امکان را می دهد تا بتوانیم سازه ژنی خود را در داخل ژنوم انگل وارد نماییم. ژن فیوز شده A2-CPA-CPB-CTE-GFP در وکتورpEGFP-N3 با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیم هاي BglII وNotI، در downstream منطقه utr1 وکتور pLEXSY ، کلون شد.
.2 تهیه پلاسمید pEGFP -A2-CPA-CPB-CTE و pLEXSY-A2-CPA-CPB-CTE در مقیاس زیاد با استفاده از کیت Midi کیاژن
