بخشی از مقاله
ارزیابی تاثیر سولفات مس بر رشد آگروباکتریوم ویتس (عامل گال طوقه درخت انگور)جداسازي شده از باغات انگور ارومیه در سال 93
چکیده
Agrobacterium vitis سومین بیوار از خانواده Agrobacterium tumefacien و عامل ایجاد تومورهایی به نام گال بر روي درخت انگور است.
انگور یکی از مهمترین میوههاي آذربایجان و به خصوص ارومیه میباشد؛ بنابراین محافظت از آن در برابر بیماريهاي باکتریایی مانند گال مهم به نظر
میرسد. این باکتريها در خاك زندگی میکنند و بیماریزاي فرصت طلب هستند. یک دوره سرما میتواند عامل بوجود آمدن زخمهایی بر روي تنه درخت انگور باشد و Agrobacterium vitis با استفاده از این زخمها وارد لایههاي درونی تنه درخت میشود. سپس پلاسمید Ti خود را به درون
ژنوم گیاه منتقل میکند. این پلاسمید قادر است ژنهاي لازم براي ترشح انواعی از هورمونها مانند اوپینها را که منجر به افزایش رشد سلولها و ایجاد تومور میشوند، را کد کند. با توجه به اینکه در سال 92 در استان آذربایجان غربی سرمازدگی موجب از بین رفتن محصولات و درختان میوه شد و تعداد زیادي از تاکستانهاي این استان به خصوص شهر ارومیه در اثر زخمهاي ایجاد شده بر تنه درختان انگور به علت سرمازدگی و ورود باکتري مذکور به درون بافتها، دچار گال طوقه درخت انگور شدند، بنابراین تلاش شد تا میزان تاثیرات سولفات مس به عنوان یک ماده ضد قارچ و ضد باکتري بر آگروباکتریوم ویتیس جدا شده از مزارع انگور ارومیه بررسی شود. براي رسیدن به این هدف ابتدا اقدام به جداسازي باکتري از تنه درختان داراي بافت-
هاي توموري مشکوك با روش آقاي مور، کرده و نمونههاي باکتریایی در شرایط استریل به آزمایشگاه میکروبیولوژي دانشگاه آزاد اسلامی واحد ارومیه ارسال شد. پس از اطمینان از جداسازي صحیح باکتريها از محیط از طریق آزمونهاي بیوشیمیایی، آزمون واکنش زنجیره پلیمراز، و کشت بر روي گیاهان پایه، اقدام به تهیه رقتهاي دو برابر کاهش یابنده از سولفات مس در لولههاي آزمایش نموده و میزان 100 میکرولیتر از باکتري در درون هر یک از لولههاي آزمایش کشت داده شد. سپس در طول زمانهاي مختلف از محلولهاي حاوي سولفات مس و آگروباکتریوم ویتیس، بر روي پلیتهاي کشت جامد ییست مانیتول آگار کشت داده و گرمخانهگذاري گردید. پس از 48 ساعت گرمخانهگذاري در دماي 28 درجه سانتیگراد مشاهده شد که کمترین غلظت مهارکنندگی رشد براي آگروباکتریوم ویتیس غلظت 100 میکرو گرم بر لیتر سولفات مس و حداقل غلظت کشندگی سولفات مس برابر با 10
میلی گرم بر لیتر در طی 24 ساعت اولیه بعد از تلقیح باکتري به محیط حاوي سولفات مس است.
کلمات کلیدي: ارومیه، سولفات مس، آگروباکتریوم ویتیس، گال طوقه انگور
مقدمه
انگور یکی از مهمترین محصولات کشاورزي در نقاط مختلف ایران و به خصوص در آذربایجان بوده و از نظر اقتصادي ارزش بالایی دارد بنابراین هر عامل
تهدید آمیزي که موجب کاهش میوهدهی انگور شود باید بلوکه گردد. گال یکی از این عوامل تهدید کننده است که توسط آگروباکتریوم ویتیس ایجاد میشود. این باکتري با استفاده از زخمهاي روي تنه درخت که توسط سرما یا اشتباهات انسانی ایجاد میشوند، وارد گیاه می شود ( Chilton et al., 1974; Chilton et al.,
.(1977 آگروباکتریوم ویتیس یک باکتري خاکزي و بیماریزاي فرصت طلب است. این باکتري پس از ورود به داخل بافت گیاه، پلاسمید خود را به درون ژنوم گیاه
انتقال داده و گیاه شروع به ساختن برخی از هورمونهاي رشد مانند اوپینها میکند. این هورمونها میتوانند موجب به هم ریختگی سیستم رشد سلولی شده و سلولها با بینظمی رشد کرده و ایجاد گال، نوعی بافت نکروزه که در ارتفاع 15 سانتیمتري سطح خاك ایجاد می شود، کند ( Burr, 1999; Chilton et al., .(1974; Chilton et al., 1977; Matthysse et al., 1986; Ream et al., 1982; Ulker et al., 1982
با توجه به این که استان آذربایجان غربی یکی از استانهاي سردسیر ایران میباشد و هر ساله سرمازدگی موجب به وجود آمدن خسارات بالایی به باغداران می شود و همچنین به دلیل شیوع بالاي بیماري گال طوقه انگور در مزارع انگور شهر ارومیه، به دنبال راهی براي از بین بردن این باکتري بیماریزاي فرصت طلب قبل از ورود آن به درون تنه انگور بودیم. در برخی از روستاهاي آذربایجان کشاورزان جهت مقابله با این بیماري اقدام به ریشه کنی درختان انگور و سوزاندن آنها میکنند که این کار موجب ایجاد خسارات مالی بسیاري میشود. از آنجایی که سولفات مس مادهاي بسیار بیضرر براي خاك و میکروارگانیسمهاي مفید خاك می باشد، در نتیجه هدف از مطالعه حاضر بررسی اثرات سولفات مس بر روي آگروباکتریوم ویتیس بود.
1
مواد و روش ها
جداسازي باکتري از محیط
براي یافتن تاثیر سولفات مس بر روي رشد آگروباکتریوم ویتیس، ابتدا سعی در جدا سازي باکتري از بافتهاي مشکوك شد. از آنجایی که در سال 92
یک دوره سرمازدگی در استان رخ داده بود، بنابراین بهترین زمان نمونه برداري براي جداسازي باکتري از اواخر بهارشروع شده و تا اوایل تابستان ادامه یافت؛ زیرا این زمان بهترین زمان براي رشد باکتري مذکور در درون تنههاي درختان و ایجاد گال طوقه است (تصویر.(1 براي رسیدن به این هدف، در روز هاي مذکور ابتدا به شناسایی روستاهایی که مشکوك به وجود نشانههاي گال در آنها اقدام شد. جامعه آماري شامل درختان انگور داراي گال در 5 مزرعه در مناطق قامت و امامزاده ارومیه 45) درجه و 12 دقیقه طول شرقی و 37 درجه و 31 دقیقه عرض شمالی ) بودند. براي این کار، ابتدا بر اساس روش آقاي مور، تنه درختان بیمار به وسیله آب
مقطر استریل و سپس با الکل 70 درصد به مدت 2 دقیقه شسته شد. سپس بافت نکروزه تا رسیدن به بافت سبز رنگ به وسیله اسکالپل استریل برداشته شد (Ataee et al., 2011)، آگروباکتریوم ویتیس اغلب در ناحیه بافت سبز رنگ زندگی میکند. بافت سبز جداسازي شده، و در درون ظروف استریل پر شده با آب مقطر استریل قرار داده شده (Moore, 1988) و به آزمایشگاه میکروبیولوژي دانشگاه ازاد اسلامی ارومیه براي انجام آزمون هاي تشخیصی فرستاده شد. این کار
براي 20 نمونه گرفته شده از 5 مزرعه پرورش انگور انجام شد (جدول.(1
جداسازي و خالص کردن باکتريها
براي خالص کردن باکتريها از بافتهاي تنه درخت ابتدا بافتها در داخل بشرهاي مجزاي حاوي200میلی لیتر آب مقطر قرار داده شده و به مدت 45
دقیقه بر روي شیکر هم زده شد، سپس محلولها با استفاده از کاغذ صافی واترمن شماره 42 صاف شده و رقت هایی تا 10 -5 از هر نمونه تهیه شدند. با استفاده از سمپلر، 50 میلی لیتر از هر رقت برداشته شده و بر روي ییست مانیتول آگار (مرك، آلمان) کشت داده شد و در انکوباتور 28 درجه سانتیگراد براي 24 تا 48 ساعت قرار داده شدند. ییست مانیتول آگار داراي مواد غذایی لازم مانند عصاره مخمر، مانیتول، دي پتاسیم فسفات، سولفات منیزم و کلرید سدیم بوده و محیط مناسبی براي باکتري مورد نظر است. پس از 48 ساعت، 5 نوع کلنی در محیطهاي کشت طبق جدول2 ظاهر شدند که براي بدست آوردن نمونههاي خالص هر کدام از کلنی-
ها به تعداد 5 بار کشت متوالی، پاساژ داده شدند. سپس 2 نمونه از کلنیها که داراي خصوصیات ظاهري مشابه آنچه که در کتاب میکروبیولوژي برگی آمده است (Garetty, 2005)، کشت مجدد داده و پس از ظاهر شدن کلنیهاي ریز سفید رنگ مرواریدي (تصویر(2 و کلنیهاي سفید رنگ مات بزرگ، آزمونهاي شناسایی
براي گونههاي باکتریایی، مشابه آنچه که براي نمونههاي استاندارد شناسایی آگروباکتریوم ویتیس انجام میشود، انجام گرفت.
تست هاي بیو شیمیایی
ابتدا رنگ آمیزي گرم را انجام دادیم. یکی از گونههاي باکتریایی گرم منفی کوکوباسیلی و دیگري گرم مثبت کوکسی بود که از این بین باکتريهاي گرم منفی باسیلی سفید مرواریدي ریز به عنوان آگروباکتریوم ویتیس احتمالی انتخاب شد. ظاهر آنها در سرم فیزیولوژي استریل و در زیر میکروسکوپ با لنز ×40 به صورت دستههاي 2 یا چندتایی چوب کبریتی بود و داراي حرکت ویبره مانند و لرزشی بودند. بنابراین باکتريها در محیطهاي افتراقی و انتخابی لازم مانند TSI،
MRVP، SIM، اوره آز ،سیمون سیترات کشت داده شده و در دماي 28 درجه سانتیگراد به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه شدند؛ همچنین آزمونهاي بیوشیمیایی مانند اکسیداز، کاتالاز، رشد در غلظت نمکی %2 و رشد در 35 درجه انجام گردید .(Garetty, 2005; Kuzmanovic et al., 2012) پس از بررسی نتایج،
مشخص شد که یکی از گونههاي باکتریایی جداسازي شده آگروباکتریوم ویتیس بود (جدول.(3
تائید باکتري با روش PCR
براي تائید باکتريهاي جدا شده از آزمون PCR استفاده شد. آزمون PCR به وسیله دو نوع پرایمر یک نوع براي آگروباکتریوم تومه فاسینیس و نوع دیگر براي آگروباکتریوم ویتیس، جمعا 4 پرایمر: 2 پرایمر فوروارد و 2 پرایمر ریورز مورد استفاده قرار گرفت .(Brencic et al., 2005; Akramee 2010) تست PCR در
جدول 4 آمده است.
آزمون هاي بیماریزایی طبیعی
جهت اطمینان از وجود عامل بیماریزا (پلاسمید) در باکتري، باکتريها بر روي گیاهان پایه کشت داده شدند.
بوته شمعدانی، بوته گوجه فرنگی و درخت انگور براي کشت باکتري در ساقه گیاهانی چون شمعدانی، بوته گوجه فرنگی و درخت انگور، ابتدا از هر گیاه، 3 نمونه که داراي شرایط فیزیولوژیکی و ظاهري
خوبی بودند انتخاب شده و به مدت یک ماه در محیط آزمایشگاهی گلخانه اي طبیعی نگهداري شدند. سپس براي انجام عملیات کشت، ساقه و تنه هر یک از گیاهان بوسیله آب مقطر استریل و الکل %70 شسته و استریل شد. سپس با استفاده از یک عدد سوزن استریل شده با الکل قسمتی از کلنیهاي کشت تازه برداشته شده و
در محل ساقه با ارتفاع 15 سانتیمتر از سطح خاك به صورت عمقی و تا عمق 2 میلی متر تلقیح شد؛ محل تلقیح با استفاده از پنبه استریل مرطوب شده با آب مقطر استریل و پارافیلم پانسمان شده و به مدت 45 تا 60 روز در محیط گلخانه اي داراي شرایط دمایی 25 تا 28 درجه سانتیگراد نگهداري شدند ( Kuzmanovic et .(al.2012 پس از طی زمان مورد نظر، مشاهده شد که کلنیهاي باکتریایی در همه ساقههاي تلقیح شده گیاه شمعدانی و همچنین تنههاي درخت انگور رشد کرده
و ایجاد بافتی شبیه بافت نکروزه در محیط طبیعی را کرده اند ولی در ساقههاي بوتههاي گوجه فرنگی رشد باکتري مشاهده نشد.
2
آزمون هاي آنتی باکتریالی
پس از انجام همه این آزمونها و اطمینان از صحت جداسازي باکتري، کلنیهاي باکتریایی آگروباکتریوم ویتیس در داخل کشت مایع پپتون واتر (مرك، آلمان) به صورت جداگانه و به روش زیر کشت داده شدند:
ابتدا 0/25 گرم از پودر محیط آب پپتونه در 10 میلی لیتر آب مقطر استریل مخلوط شده و جهت استریل شدن محیط در اتوکلاو به مدت 20 دقیقه حرارت داده شد. سپس 2 کلنی از باکتريهاي محیط جامد بوسیله لوپ استریل در محیط مایع کشت داده شده و در انکوباتور 28 درجه سانتیگرادي به مدت 48
ساعت گرمخانهگذاري شد. در مرحله بعدي، به تعداد 30 لوله آزمایش آب مقطر به میزان 10 میلی لیتر در انکوباتور به مدت 20 دقیقه حرارت داده شدند تا استریل گردند؛ پس از سرد شدن لولهها، میزان 1 گرم از سولفات مس (مرك، آلمان) در داخل یکی از لولههاي آزمایش حاوي 10 میلیلیتر آب مقطر استریل ریخته شده و به وسیله شیکر مخلوط شد، سپس به وسیله سمپلر، میزان 100 میکرولیتر از محلول سولفات مس به لوله آزمایش دوم حاوي 10 میلی لیترآب مقطر استریل اضافه شده و به وسیله شیکر هم زده شد تا رقت 10 -2 ایجاد گردد؛ این کار تا تهیه رقت 10 -8 انجام شده و از لوله آزمایش آخر هم 100 میکرولیتر برداشته شده و دور ریخته شد. پس از انجام این مراحل به هر یک از لولههاي آزمایش میزان 100 میکرولیتر از محلول کشت مایع آلمانحاوي آب پپتونه (مرك، ) و آگروباکتریوم ویتیس، انتقال داده شد. کشت زمان صفر دقیقا پس از تلقیح بر روي پلیتهاي حاوي محیط تریپیک سوي آگار و ییست مانیتول آگار انجام گرفت و پس از نوشتن مشخصات در انکوباتور به مدت 48 ساعت و در دماي 28 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. پس از گذشت زمانهاي 2، 4، 6، 22 و 24 ساعت از زمان تلقیح نیز کشت بر روي محیطهاي مذکور به تعداد 2 تکرار انجام شد.
جدول -1نمونه هاي گرفته شده از 5 مزرعه
جدول -2 خصوصیات ظاهري کلنی هاي جداسازي شده از محیط طبیعی
جدول :3 مشخصات پرایمرهاي استفاده شده در این مطالعه براي تائید آگروباکتریوم ویتیس .
3
جدول -4 ویژگی هاي بیوشیمیایی آگروباکتریوم ویتیس
جدول -5 میزان تاثیر سولفات مس در رقتها و زمانهاي مختلف بر رشد آگروباکتریوم ویتیس .(CFU/ml)
تصاویر
تصویر-1نمایی از درخت انگور آلوده به گال طوقه تصویر-2کلنی هاي باکتریایی آگروباکتریوم ویتیس
