بخشی از مقاله
چکیده:
انتقال ژنهاي خارجی به کلروپلاست گیاهان داراي مزایاي زیادي است که میتوان به بیان بالاي پروتئینهاي خارجی و عدم آلودگی زیست محیطی اشاره کرد. با توجه به توالی یابی ژنوم پلاستید کاهو میتوان قطعات همولوگ زیادي را براي طراحی وکتور استفاده کرد. در این تحقیق از قطعات همولوگ rbcL-accD و پروموتر Prrn و ترمیناتور psbA براي ژن هدف همراه قطعه ژنی BADH مقاومت به بتائین آلدهید به همراه پروموتر 16S rrn و ترمیناتور psbA گیاه کاهو براي ساخت وکتورpcL96-39-B پلاسمید کلروپلاستی کاهوي Lactuca sativa رقم TN-96-39 ایرانی استفاده شده است. این سیستم راه تولید وسیع داروهایی همانند پروتئینهاي پلاسما، آنزیم ها، فاکتورهاي رشد، واکسن ها، آنتی باديهاي نوترکیب را در گیاه کاهو که بصورت خوراکی مصرف میشوند هموار خواهد کرد.
مقدمه
اخیرا گیاهان، بعنوان سیستم بیان ژنها، جهت تولید واکسن به دلایل مزایاي زیاد مورد توجه دانشمندان قرار گرفتهاند - . - 1 تولید واکسنهاي خوراکی موضوع جذابی در بیوتکنولوژي بوده زیرا مدیریت را آسان و هزینهها را به شدت کاهش میدهد. خوراکی شدن پروتئینهاي نوترکیب میتواند هزینه تولید را تا %90 کاهش دهد. امروزه در مهندسی ژنوم کلروپلاستی استفاده از آنتی بیوتیک یک مشکل اساسی بوده که براي حل این مسئله به روشهاي جدیدي متوسل شدهاند. در گیاهان عالی، پستانداران و باکتريها ژنی بنام - betaine aldehyde dehydrogenase - BADH وجود دارد.
این آنزیم میتواند سم بتائین آلدهید 1 را به گلیسین بتائین2 که یک ماده غیر سمی است، تبدیل نماید. حضور گلیسین بتائین درسلول باعث محافظت3 اسمزي گیاه در برابر آب نمک و یا استرس محیطی میگردد. در گیاهان و باکتريها گلیسین بتائین علاوه بر بالا بردن قدرت اسمزي سلول مانع عملکرد سلول نمی شود. اگر در کشت سلولی براي انتخاب سلولهاي نوترکیب از بتائین آلدهید استفاده گردد با استفاده از ژن آنزیم BADH ترانسفورم شده میتوان عمل غربالگري را انجام داد. بتائین آلدهید دهیدروژناز - BADH - قادر به زدودن سموم آلدهید betaine در سلول گیاهی بوده و سلولهاي گیاهی ترانسفورم شده در محیط کشت حاوي آلدهید betaine رشد کرده و با این تکنیک سلولهاي ترانسفورم شده را میتوان انتخاب کرد . - 2 - در طراحی وکتور پلاستیدي دو جایگاه داراي همولوژي کامل با کلروپلاست
لازم است که تاکنون از 14 جایگاه دوتایی استفاده نمودهاند - . - 3 در طراحی وکتور پلاستیدي کاهو، هیروساکی4 و همکاران - 5 - از جایگاه rbcL–accD و سیلیا5 و همکاران - - 6 از trnI–trnA بعنوان قطعات همولوژي جهت انتقال ژن به کلروپلاست استفاده کردهاند. کاهو یکی از قدیمیترین سبزیجات دنیا و داراي بیوماس بالایی است. درحال حاضرکاهو در76 کشور جهان بصورت سنتی وگلخانهاي و در چهار فصل کشت و از برگهاي آن به عنوان سالاد استفاده میشود.
با تولید گیاهان تراریخته در سطح وسیع داروهایی همانند پروتئینهاي پلاسما، آنزیمها، فاکتورهاي رشد، واکسنها، آنتی باديهاي نوترکیب را میتوان تولید کرد. میزان بیان ژنهاي خارجی در کلروپلاست گیاهان مختلف، متفاوت بوده و از %2 تا%47 کل پروتئین محلول را گزارش کردهاند - . - 4گیاه کاهو با توجه به نوع مصرف و بیوماس آن داراي پتانسیل مطلوب براي تبدیل شدن به یک بیوراکتور جهت تولید پروتئینهاي نوترکیب و واکسنهاي خوراکی است. میزان بیان پیش انسولین6 و 7GFP به ترتیب به مقدار %2/5 و%36 کل پروتئین محلول در برگهاي تازه کاهو گزارش شده است
مواد و روشها: استخراج DNA ژنومی کاهو و ساخت وکتور پلاستیدي کاهوي ایرانی DNA ژنومی کاهو به روش CTAB استخراج و با استفاده از جفت پرایمرهاي طراحی شده قطعات همولوگ پلاستیدي و راه اندازها و پایان دهندههاي مربوطه از روي DNA گیاه کاهو بوسیله تکنیک PCR تکثیر وبه همراه ژن BADH صناعی در وکتور pGEM-T همسانهسازي شدند و وکتور ساخته شده با عنوان pcL96-39 -B نامگذاري گردید.
نتایج: تکثیر قطعات به وسیله آنزیم Taq و Pfu پلیمراز
ژنهاي مورد نظر از DNA گیاه کاهو با استفاده از تکنیک PCR و پرایمرهاي طراحی شده براي ژنهاي - 1100bp - rbcL - 1100bp - accDL ، - 113bp - prrn و - 339 bp - psbA استخراج شدند. محصولات PCR بر روي ژل آگارز %1 در شکل - 1 - به نمایش درآمده است. ژنهاي - 113bp - prrn و - 339 bp - psbA با استفاده از تکنیک SOEing-PCR امتزاج یافتند و به یک قطعه 454bp تبدیل گردید.
شکل - - 1 قطعات ژن هاي ژنهاي - 1100bp - accDL - 1100bp - rbcL ، - 113bp - prrn و - 339 bp - psbA تکثیر شده با آنزیمTaqپلیمراز هضم آنزیمی وکتورpcL96-39 -B با آنزیمهاي مختلف براي تایید نهایی به منظور تایید وجود ژنها در وکتورpcL96-39 -B نوترکیب، برش با آنزیم هاي XhoI, HindIII , PstI انجام شد. محصول پیش بینی شده از برشها بر روي ژل آگارز %1 در شکل - 2 - نشان داده شده است. اندازه قطعات حاصل از این برش هماندازه قطعات مورد نظر بودند.
شکل - - 2 قطعات حاصل از برش آنزیمی بر روي پلاسمید pCL96-39-B ساخته شده برروي ژل آگارز %1 نشان داده شده است که شامل: -1 ستون 1 شامل: سایز مارکر 250-10000bp
-2 ستون 2 شامل: - BADH- 2040 bp - و قطعه5891 bp شامل قطعات - - rbcL-1100bp - - pGEM-T-3000bp ، - accD-1100 bp - , - prrn- MCS - TpsbA =681bp - میباشد.
-3 ستون 3 شامل: - BADH- prrn- MCS = 2388 bp - و قطعه5543 bp شامل قطعات - - rbcL-1100bp - - pGEM-T-3000bp ، - accD-1100 bp - , - TpsbA+5bp =343bp - می باشد
بحث
سیستم بیان ژنها درکلروپلاست گیاهان جهت تولید واکسنهاي خوراکی به دلایل مزایاي زیاد مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است. ترانسفورماسیون به پلاستید گیاهان وابسته به طراحی و تهیه وکتور اختصاصی پلاستیدي، انتقال وکتور پلاستیدي به وسیله تفنگ ژنی - 7و - 8 یا پلی اتیلن گلایکول - - 6، الحاق ژن به پلاستید ژنوم گیاه بوسیله نوترکیبی در نواحی طراحی شده همتا و غربالگري سلولهاي ترانسفورم شده و باززایی آنها در محیط آنتی بیوتیک و سمومی همانند بتائین آلدئید است. کلروپلاست گیاهان یک میزبان ایدهال براي بیان ژنهاي خارجی میباشد.
