بخشی از مقاله
چکیده
FSH از خانواده هورمون هاي گلیکوپروتئینی هیپوفیز ومتشکل از دو زیر واحد آلفا و بتا می باشد که فعالیت بیولوژیک این هورمون مربوط به زیر واحد بتاي آن است. این مطالعه به منظورتهیه و ساخت ناحیه کد کننده ژن انسانی FSHβ بدون سیگنال سکانس طبیعی ژن و کلونینگ آن در شاتل وکتورpPIC9 انجام شد. طی چند مرحله امپلیفیکاسیون و کلونینگ، ابتدا اگزونهاي دو و سه این ژن،از ژنوم انسان با روش PCR جدا و پس از کلونینگ در pTZ57R و تعیین توالی به یکدیگر متصل و نهایتاً در pPIC9 کلون گردید.
وکتور نوترکیب ساخته شده در این مطالعه شامل ناحیه کد کننده ژن FSHβ بوده که قادر است این ژن را در ژنوم مخمر تحت پروموتر AOX1 وارد کند که در این حالت فیوژن پروتئینی شامل سیگنال پپتید آلفا فاکتور و FSH به وجود می آید. FSHβ به نحوي بیان خواهد شد که سیستم مخمري قادر به جدا سازي آلفا فاکتور باشد. به نظر می رسد این نخستین تلاش براي کلونینگ ژن انسانی FSHβ در سیستم مخمري باشد.
مقدمه
FSH یکی از چهار عضو خانواده هورمونهاي گلیکوپروتئینی بخش پیشین غده هیپوفیز است که متشکل از دو زیر واحد آلفا و بتا تشکیل و توسط پیوندهاي غیر کوئووالان به یکدیگر اتصال یافته اند - 1و. - 2 زیر واحد بتاي این هورمونها از نظر اسیدهاي آمینه و جزء کربوهیدراتی با یکدیگر متفاوت هستند و عامل اختصاصی بودن و فعالیت بیولوژیک این هورمونها به شمار می رود - 2و4و. - 8 زیر واحد بتاي FSH انسانی در موقعیت کروموزومی 11pter-p11.2-13 قرار دارد و داراي 111 اسید آمینه و شش پل دي سولفیدي و سیگنال سکانس 54 نوکلئوتیدي می باشد که در سمت 5´ اگزون دو قرار دارد. این زیرواحد شامل سه اگزون و دو اینترون می باشد که تنها اگزون دوم و بخشی از اگزون سوم داراي ناحیه کد کننده می باشد.
داراي یک محل گلیکوزیلاسیون در Cys28-Ala-Gly-Tyr31 - CAGY - و دو آسپاراژین در ناحیه 7 و 24 می باشد - . - 7 از FSH در مواردي از جمله: تحریک تخمک گذاري جهت - 5 - IVF، درمان بیماریهایی نظیر - 9 - PCO، درمان نازایی ها ناشی از عدم تخمک گذاري - 6 - و کیتهاي تشخیصی استفاده می شود. مخمر متیلوتروف ، Pichia pastoris که توسط شرکت Invitrogen ارائه شده است به عنوان یک سیستم بیان براي تولید مقادیر بالاي پروتئین هاي نوترکیب مورد استفاده تجاري و تحقیقاتی می باشد.
پروتئین نوترکیب تولید شده با سیگنال ترشحی آلفا فاکتور مخمر یا خود ژن قادر است درمسیر ترشحی مخمر هدایت شود، مسیري که در آن تشکیل باند هاي دي سولفیدي و گلیکوزیلاسیون می تواند قبل از ترشح پروتئین نوترکیب به داخل محیط کشت صورت پذیرد - 2و. - 3 تلاش براي جدا سازي ژن FSH از انسان و حیوانات و کلونینگ آن به روش هاي مختلفی انجام شده است. در سال Shoham1996 و همکارش RNA سلولی را از سلولهاي غدهء هیپوفیز انسان جدا کرده و یک کتابخانه cDNA به منظور جداسازي ژن زیرواحد بتاي FSH-ß تهیه نمودند - . - 6 این مطالعه به منظور جداسازي ناحیه کد کننده ژنFSHβ انسان بدون سیگنال سکانس طبیعی آن و کلونینگ آن در pPIC9 به منظور بیان در P.pastoris انجام شده است.
مواد و روشها
DNAي ژنومیک از خون یک زن سالم جدا شد. با استفاده از دو جفت پرایمراگزونهاي دو و سه جداسازي و پس از کلونینگ در pTZ57R/T به درون سلول E.coli XL1 blue ترانسفورم گردیدند. با انجام تستهاي تأییدي و نهایتاً تعیین توالی صحت کلونها مشخص شد. و سرانجام طی سه مرحله PCR و بصورت overlap دو اگزون به هم متصل و براي کلونینگ در پلاسمید pPIC9 امپلیفیه گردید. قطعه تکثیر شده در جایگاه XhoI و EcoRI پلاسمید pPIC9 کلون شد. پلاسمید هاي حاصل با روشPCR مجدد، Nested PCR و Restriction analysis بررسی و یک کنستراکت انتخاب و pPIC-F2.1.336 نامگذاري گردید و نهایتاً به روش sanger تعیین توالی گردید.
نتایج و بحث
از کلونهاي بدست آمده چهار کلون که از نظر اندازه پلاسمید مورد انتظار بودند انتخاب شدند و آنالیز آنزیمی با استفاده از آنزیم هاي BglII و EcoRI نشان داد که هر چهار کلون واجد ژن زیر واحد بتا می باشند - شکل . - 1 از بین این کلونها دو کلون انتخاب و تعیین توالی گردید که نتایج تعیین توالی تطابق کامل این ژن را در یکی از کلون ها با ژن ثبت شده در GenBank و تطابق صد در صد پروتئین مربوطه را نشان می دهد. این پلاسمید نوترکیب قادر است ناحیه کد کننده ژن را تحت پروموتر AOX1 به ژنوم مخمرداخل کند. بیان این ژن بصورت فیوژن و فریم با سیگنال ترشحی آلفا فاکتور می باشد که در این شرایط سیستم KEX2 و STE13 موجود در میزبان سیگنال پپتید را جدا ساخته و FSHβ بصورت ترشحی بیان خواهد شد.
