بخشی از مقاله
تهيه وکتور مناسب براي انتقال ژن SOS٣ به گياه ذرت
چکيده :
شوري خاک از مهمترين عوامل کاهش دهنده عملکرد گياهان و توليد محصولات کشاورزي مي باشد. بيان بيشينه ژنهاي دخيل در مسيرهاي مقاومت در برابر شوري، از قبيل مسير تنظيم هموستازي يوني SOS، يکي از مهمترين و موثرترين روشها براي افزايش مقاومت گياه مي باشد. ژن SOS٣ يکي از ژن هاي کليدي در اين مسير تنظيمي بوده و در اصل باعث فعال سازي اين مسير مي شو . از آنجا که ذرت يک گياه نسبتاً حساس به شوري بوده و شوري خاک از مهمترين عوامل محدود کننده توليد ذرت در حال حاضر و آينده بشمار مي رود، لذا توليد ذرت هاي تراريخت با بيان بيشينه اين قبيل ژن ها مي تواند از کاهش عملکرد و سطح کشت اين گياه استراتژيک در آينده جلوگيري کند. با توجه به اينکه وجود وکتورهاي بيان مناسب براي انتقال پايدار ژن هدف در گياه ذرت از عوامل ضروري مي باشد، لذا در اين پروژه به طراحي و ساخت وکتور بيان مناسب براي انتقال پايدار ژن SOS٣ به گياه ذرت با روش تفنگ ژني پرداخته شد. براي اين منظور، ابتدا مناسبترين استراتژي براي کلون کردن cDNAي ژن SOS٣ که قبلا در آزمايشگاه بيوتکنولوژي دانشگاه شهيد مدني آذربايجان جداسازي و در وکتور pGBKT٧ کلون گرديده بود، طراحي و پس از چندين مرحله کار عملي، وکتور بيان مناسب براي انتقال آن به گياه ذرت تهيه گرديد. در مرحله اول ، ژن SOS٣ از وکتور pGBKT٧ جداسازي و در وکتور pMA٤ در بين پروموتر S٣٥ CaMV و ترميناتور Tnos کلون گرديد. وکتور حاصل pER١ نامگذاري ش . سپس ژن گزينشگر manA که کد کننده فسفومانوز ايزومراز است ، بعنوان ژن گزينشگر از وکتور pMA٥ جداسازي و در وکتور pER١ کلون شد. وکتور حاصل pER٢ نامگذاري شد که مي تواند براي انتقال ژن به ذرت و ساير گياهان فاقد ژن manA با استفاده از روش ريزپرتابي، مورد استفاده قرار گيرد.
کلمات کليدي : ذرت ، شوري، ژن SOS٣، وکتور بيان SOS٣
مقدمه
شوري خاک از مهمترين عوامل کاهش عملکرد محصولات کشاورزي ميباشد. تجمع زياد يونهاي سديم در خاک شور، باعث افزايش غلظت يون سديم در داخل سلولهاي گياهي شده و اثر نامطلوبي بر روي متابوليسم سلولي و هموستازي يوني ميگذارد. در گياهان مکانيسمهايي وجود دارند که جذب يونهاي سديم را کاهش ميدهند (١و٢). مسير هموستازي يوني
SOS، يکي از اين مکانيسم ها جهت تنظيم غلظت يونها در شرايط تنش شوري مي باشد، که در نهايت منجر به افزايش تحمل
در مقابله با شوري مي شود. در اين مکانيسم ، آنتيپورتر +H.Na+ غشاي پلاسمايي که توسط ژن SOS١ کد مي شود، باعث
خروج يون سديم از سيتوپلاسم و کاهش سميت آن ميشود. در اين ميان ، ژن SOS٣ يک پروتئين متصل شونده به کلسيم را کد ميکند که با تشکيل کمپلکس با پروتئين SOS٢، باعث فعال شدن آنتيپورتر SOS١ و خروج يون سديم از سيتوزول شده و در نتيجه ، مقاومت گياه در برابر تنشهاي محيطي افزايش مي يابد ( ٣ . فعاليت اين مسير تا بحال در چندين گياه من جمله غلاتي از قبيل ذرت شناسايي شده اند ( ٤ . بيان بيشينه ژنهاي موجود در مسير تنظيمي SOS در برخي گياهان من جمله سيب زميني شيرين (٥) و آرابيدوپسيس ( ٣)، باعث بهبود مقاومت به شوري در گياهان تراريخت شده است . مطالعات اخير روي گياه آرابيدوپسيس نشان مي دهند که در شرايط استرس شوري، SOS٣ در توسعه ريشههاي جانبي از طريق افزايش توليد هورمون اکسين و انتقال دوطرفه آن ، دخيل مي باشد ( ٦ . اين مطالعات نشان ميدهند که SOS٣ يکي از اجزاي مهم مسير پيام رساني SOS مي باشد و در راهاندازي اين مسير در مقابله با تنش شوري نقش کليدي دارد. از طرف ديگر، ذرت بعنوان يکي از مهمترين غلات در تغذيه بسياري از مردم دنيا نقش اساسي دارد. بطوريکه ، سطح زير کشت و مقدار مصرف ذرت در طي سال هاي اخير در اغلب کشورهاي جهان افزايش شديدي نشان مي دهد. ذرت يک گياه نسبتا حساس به شوري بوده و با افزايش شوري، عملکرد آن کاهش مييابد. بنابراين ، بايد به دنبال راهکارهايي بود که مقاومت ذرت را در برابر استرسهاي محيطي افزايش داد. همچنانکه اشاره گرديد، بيان بيشينه ژنهاي مربوط به مسيرهاي مقاومت ، از قبيل مسير تنظيم يوني SOS، مي تواند اثر بزرگي روي افزايش مقاومت به شوري و برخي ديگر از استرسهاي محيطي داشته باشد. با توجه به نقش کليدي SOS٣ در مسير تنظيمي SOS و با توجه به اينکه تهيه وکتورهاي مناسب براي انتقال موفق و پايدار ژن هدف به گياه يکي از عوامل ضروري براي دستکاري هاي ژنتيکي مي باشد، لذا در اين تحقيق ، طراحي و ساخت يک وکتور مناسب براي انتقال پايدار و بيان ژن SOS٣ در گياه ذرت در دستور کار قرار گرفت .
مواد و روشها
براي استخراج پلاسميد از روش پيشنهاد شده توسط Birnboim و Doly استفاده شد (٧). غلظت اسيدهاي نوکلئيک از طريق اندازه گيري چگالي نوري آنها و يا الکتروفورز روي ژل آگارز تعيين گرديد. برش DNAي پلاسميد توسط اندونوکلئازهاي مناسب و با استفاده از بافرهاي توصيه شده توسط شرکت سازنده ي آنزيم انجام گرفت . براي خالص سازي قطعات DNA از روي ژل ، از آگارز با نقطه ي ذوب پايين (LMP) و بر اساس پروتوکول هاي استاندارد استفاده گرديد. براي اتصال دو قطعه ي
DNA (واکنش ليگاسيون )، مواد لازم براي ١٥ ميکروليتر واکنش شامل ٣٠٠-١٠٠ نانوگرم DNA ي ناقل برش يافته با آنزيمهاي مورد نظر، DNAي الحاقي به نسبت ١ تا ٣ برابر وکتور، ١.٥ ميکروليتر بافر DNA ligase-T٤×١٠ و ٥ واحد آنزيم DNA ligase-T٤، در تيوب ريخته شده و در دماي C°١٦ به مدت يک شب قرار داده شدند.
واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR) براي اثبات حضور فيزيکي ژن در وکتورهاي توليد شده استفاده گرديد. براي تهيه ي محلول واکنش ، ٥٠ نانوگرم DNA، ٥٠ ميلي مولار از مخلوط dNTPها، ٢ ميلي مولار از محلول MgCl٢، ٨٠ نانوگرم از هر کدام از پرايمرها و ٢ واحد از آنزيم Taq DNA Polymerase اضافه شد. برنامه ي استاندارد PCR شامل مرحله ي واسرشته سازي اوليه به مدت ٤ دقيقه در C°٩٤ و در ادامه مرحله ي تکثير که شامل ٣٥ چرخه و هر چرخه شامل ٣٠ ثانيه دماي C°٩٤،
٣٠ ثانيه دماي C°٦٠ و ٤٥ ثانيه دماي C°٧٢، و در نهايت يک مرحله ي پاياني شامل ٦ دقيقه در دماي C°٧٢ بود.
از بسته نرم افزاري ٧ Lasergene براي شبيه سازي کلونينگ و تهيه مناسبترين استراتژي هاي کلونينگ استفاده گرديد.
نتايج و بحث
يکي از مراحل مهم تهيه وکتور بيان ، تهيه يک چارچوب رونويسي و ترجمه مناسب براي ژن مورد نظر مي باشد. براي اين منظور مناسبترين استراتژي از طريق بررسي توالي وکتورهاي در دسترس توسط نرم افزار ٧ Lasergene تعيين و به ترتيب زير عمل گرديد. ابتدا وکتور pGBKT٧ با اندازه bp ٧٩٨٠ که حاوي ژن SOS٣ با اندازه bp ٦٦٩، با آنزيم برشي XbaI که بلافاصله قبل از کدون آغاز طراحي شده بود، برش داده شد . سپس قطعات به دست آمده بر روي ژل آگارز بارگذاري گرديد و باند ٤٥٠٠ جفت بازي حاوي ژن SOS٣ از روي ژل آگارز جداسازي، و با استفاده از کيت Vivantis, ) GF-1 Ambiclean Malaysia) خالص گردي . در مرحله بعد، قطعه خالص سازي شده با آنزيم برشي EcoRI که پس از کدون پايان طراحي شده بود، برش داده شده و پس از بارگذاري بر روي ژل آگارز، قطعه bp ٦٦٩ مربوط به ژن SOS٣ از روي ژل آگارز جداسازي و با استفاده از کيت خالص گرديد. سپس ، قطعه حاصل با استفاده از همان سايتهاي برشي در وکتور pMA٤(وکتوري که در آن ژن PSY در بين پروموتر S٣٥ CaMV و ترميناتور Tnos قرار دارد) در بين پروموتور و ترميناتور بجاي ژن PSY، کلون گرديد. وکتور حاصل pER١ نامگذاري گرديد که در آن چارچوب بيان ژن SOS٣ در جهت صحيح ساخته شد (شکل ١).
وکتور نوترکيب حاصل ، از طريق PCR و برش آنزيمي و مطالعه قطعات حاصل ، مورد تاييد نهايي قرار گرفت .
شکل ١- نقشه شماتيک وکتور pER١. براي تهيه يک کاست بيان مناسب ، cDNAي ژن SOS٣ با استفاده از سايتهاي برشي XbaI و EcoRI از وکتور
pGBKT٧ جداسازي و در وکتور pMA٤ جايگزين ژن PSY گرديد.
در مرحله بعد، براي تکميل وکتور بيان ، بايد يک ژن گزينشگر در وکتور جاسازي مي شد. سيستم مانوز.pmi بعنوان يک روش مناسب براي گزينش سلولهاي تراريخت ذرت شناخته شده است ( ٨). ژن گزينشگر pmi يا manA کد کننده فسفومانوز ايزومراز است ، که باعث تحريک رشد سلولهاي تراريخته روي محيط کشت حاوي مانوز ميشود، در حاليکه سلولهاي غير تراريخت قادر به استفاده از مانوز نيستند. از آنجا که اين ژن هيچگونه مقاومتي در برابر داروها و آنتي بيوتيکها ايجاد نکرده و هيچگونه خطري براي موجودات زنده ندارد، لذا اين سيستم در حال حاضر براي گزينش گياهان تراريخته بيشتر مورد توجه قرار گرفته است .
براي اين منظور، کاست ژن manA از وکتور pMA٥ (اهدايي پروفسور R. Bock از انستيتوي ماکس پلانک آلمان ) با استفاده از آنزيمهاي برشي SacII و NcoI جداسازي، و در وکتور pER١(شکل ١) با استفاده از همان سايتهاي برشي کلون گرديد.
