مقاله مرور بر کشت بافت خرما ( Phoenix dactylifera L . )

بخشی از مقاله

مرور بر کشت بافت خرما (Phoenix dactylifera L.)

چکیده

خرما (Phoenix dactylifera L.)، از گذشتههاي دور یکی از مهمترین محصولات نواحی خشک کشورهاي عربی، آفریقاي شمالی و خاورمیانه بوده است. افزایش خرما به سه روش بذري، پاجوش و کشت بافت ممکن میباشد. افزایش بذري، به دلیل مشکلات مربوط به تعداد زیاد گیاه نر تولیدي، هتروزیگوت بودن و تفرق صفات صورت نمیگیرد و بیشتر براي برنامههاي بهنژادي به کار میرود . از سوي دیگر، استفاده از پاجوش نیز با محدودیتهایی مانند تعداد کم پاجوش در گیاه و سخت ریشهدهی روبرو است. به دلیل معایب این دو روش در افزایش خرما، استفاده از یک روش مناسب و اقتصادي براي افزایش انبوه و سریع این گیاه داراي اهمیت زیاد میباشد. کشت بافت یکی از روشهاي اصلی استفاده شده براي افزایش انبوه و سریع تعداد زیادي از گونههاي گیاهی داراي اهمیت اقتصادي مانند خرما میباشد. این روش؛ شامل اندامزایی بدنی، رویانزایی و غیره میباشد. از سودمنديهاي ریزافزایی میتوان به تولید تعداد زیاد گیاه با کیفیت از یک گیاه، تولید گیاهان خرماي عاري از بیماري و آسانی حمل و نقل خرماهاي کشت بافت شده اشاره کرد. با وجود مزایاي این تکنیک در افزایش خرما، این روش با تنگناهایی مانند قهوهاي شدن و شیشهاي شدن بافتها، پاکوتاهی، گرده افشانی ناموفق و میوهدهی غیرنرمال روبرو است.

کلمات کلیدي: خرما، کشت بافت، رویانزایی بدنی، نابسامانیهاي فیزیولوژیک.

مقدمه

خرما (Phoenix dactylifera L.)، گیاهی دو پایه، چند ساله، تک لپه و از تیره گیاهشناسی Arecaceae میباشد Abul-) .(Soad et al ., 2010 این گیاه، از گذشتههاي دور یکی از مهمترین محصولات نواحی خشک کشورهاي عربی، آفریقاي شمالی و خاورمیانه بوده است. درخت خرما یا نخل از گیاهان بسیار قدیمی و مقدس است که نامش در قرآن مجید 42 بار تکرار شده است و مسلمانان آن را از میوههاي بهشتی میدانند. در دیانت مسیح برگ خرما سمبل و نشانه شهادت و روح شهدایی است که در راه دیانت حضرت مسیح جان باختهاند. این میوه سرشار از انواع ویتامین از جمله A، B، C و E و داراي فلزات معدنی مثل فسفر، کلسیم، آهن، ید و منیزیم میباشد که هر کدام از این مواد در سلامتی انسان بسیار مهم میباشند (سایت پزشکان بدون مرز). پیشینه کشت خرما در آفریقاي شمالی و خاورمیانه به 5000 سال میرسد که به دلیل سابقه طولانی کشت، پراکندگی گسترده و تغییر رقمهاي گوناگون، منشا اصلی این گیاه ناشناخته است، اما به احتمال فراوان این گیاه از نواحی باستانی عراق (جنوب عراق) یا غرب هند منشا میگیرد. در طی سه قرن گذشته، خرما به نواحی جدید تولید مانند استرالیا، هند، پاکستان، مکزیک، آفریقاي جنوبی و ایالات متحده آمریکا معرفی شده است .(Chao et al. 2007) سطح زیر کشت خرما در جهان 1,190,476 هکتار و میزان تولید آن به بیش از 5 میلیون تن میرسد. ایران، بزرگترین تولید کننده این محصول(18٪)، امارات متحده عربی، بزرگترین صادر کننده 37)٪) و هند، بزرگترین وارد کننده 38)٪) آن در جهان میباشند ( Asemota et.(al. 2007

افزایش

افزایش خرما، با بذر، پاجوش و تکنیکهاي کشت بافتی (Tissue culture techniques) میباشد .(Gabr et al. 2010) ماهیت دوپایه بودن خرما، باعث محدودیت در افزایش بذري میگردد .(Eke et al. 2005) افزون بر این، از افزایش بذري به دلیل محدودیتهاي دیگر مانند خفتگی بذر، درصد جوانهزنی پایین (Aslam et al ., 2009)، تعداد زیاد گیاه نر، تفرق صفات ناشی از هتروزیگوت بودن (Gabr et al. 2010)، مدت زمان طولانی مورد نیاز براي بلوغ دانهالها و تاخیر در مرحله گلدهی و میوهدهی (Othmani et al. 2009)، براي تولید تجاري استفاده نمیشود. از این رو، درختان ماده از درختان نر، تا سالها پس از انتقال به مزرعه قابل تشخیص نیستند .(Othmani et al. 2009) پتانسیل نشانگرهاي بیوشیمیایی و مولکولی در تشخیص جنسیت نخلهاي مزرعهاي و تمایز یافته از کشت بافت، بررسی شده است. از آنجا که باردهی این گیاه پس از 5 سال آغاز می گردد؛ تعیین جنسیت آن در مراحل اولیه رشد، در سرعت بخشیدن به برنامههاي اصلاحی و در هنگام احداث نخلستان بسیار مهم میباشد. بر این اساس، برنامهریزي براي گزینش نخل خرماي مقاوم و پرمحصول احتیاج به شناسایی نشانگرهاي مولکولی دارد (پورنبی و همکاران، .(1390 تکنیکهاي کشت بافت، یک راهکار مناسب براي پرآوري سریع همگروههاي جنس خرما و دیگر گیاهان دوپایه مشابه میباشد .(Bekheet et al. 2008) از سوي دیگر، استفاده از پاجوش نیز با محدودیتهایی مانند تولید تعداد کم پاجوش در هر گیاه، سخت ریشهدهی پاجوشها و عدم تولید پاجوش در برخی نژادگانها (ژنوتیپها) روبرو میباشد .(Asemota et al. 2007) تکنیک کشت بافت یک روش علمی کشت سلول، بافتها و یا اندامهاي جدا شده از گیاه مادري روي یک محیط مصنوعی میباشد .(George et al. 2008)

کشت بافت

تعداد بسیار زیادي از درختان نخل خرما در کشورهاي عربی به دلیل بیماري (مراکش)، تخریب زیستگاه (مصر) و یا جنگ (عراق) از بین رفته است. گسترش نخلستانهاي از بین رفته در اثر عوامل یاد شده، با دشواري روبروست. به دلیل محدودیت روشهاي افزایش و نگهداري کارآمد، کشت بافت و روشهاي زیست شناسی مولکولی، پتانسیل بسیار بزرگی در جمعآوري، پرآوري و نگهداري ذخیره ژنتیکی (ژرمپلاسم) خرما دارند. نگهداري طولانی مدت ژرمپلاسم خرما توسط روشهاي نگهداري در دماي پائین((Cryopreservation گزارش شده است. همچنین، پوششدار کردن رویانهاي بدنی (Encapsulation)، در آلجینات سدیم، اخیرا به عنوان یک روش براي جابهجایی مواد گیاهی واریتههاي خرما به کار رفته است .(Bekheet, 2010)

اگرچه، کشت شاخساره (shoot culture)، به عنوان یک روش بسیار قابل قبول براي ریزافزایی شناخته شده است، اما ارزش این روش به کندي درك شد و استفاده از آن به مقدار زیادي به پیشرفت تکنولوژي کشت بافت بستگی دارد. به نظر میرسد(1922) Robbins، نخستین شخصی بوده است که موفق به کشت نوك شاخساره (shoot tips) روي محیط کشت حاوي قند شده است . وي ریز نمونههاي انتهایی با اندازه 1/75 تا 3/75 میلیمتر جدا شده از نخود، ذرت و کتان را در محیط کشت مایع قرار داده بود که به دلیل نگهداري کشتها در جاي تاریک، ریز نمونهها فقط شاخسارههایی با برگهاي با کلروفیل کم و تعداد ریشه کم تولید کردند .(George et al. 2008)

این تکنیک براي افزایش تعدادي از نخلهاي با ارزش (نارگیل، نخل روغنی و خرما)، به کار رفته است و یکی از امیدبخشترین روشها براي افزایش سریع همگروههاي نخل میباشد .(Abul-Soad et al. 2010) براي از بین بردن تنگناهاي مربوط به افزایش بذري و پاجوش در خرما و همچنین تامین مواد گیاهی مورد نیاز، توسعه روشهاي افزایش خرما در کشت بافت ضروري میباشد .(Aslam et al. 2009) به طور معمول، افزایش خرما با استفاده از روش کشت بافت شامل سه روش رویانزایی، اندامزایی و استفاده از گلهاي جوان (young flowers) میباشد .(Alkhateeb, 2008)

بر پایه بررسیها، افزایش کشت بافتی خرما به دو روش رویانزایی بدنی (somatic embryogenesis) و مریستم انتهایی (meristim apexes) و یا جوانه محوري پایین برگ، با موفقیت همراه بوده است .(Gabr et al. 2010) همچنین، گزارشهایی مبنی بر ریزافزایی خرما به شیوه اندامزایی و رویانزایی وجود دارد (Aslam et al. 2009) اما اندامزایی در خرما، به دلیل تعداد محدود ریزنمونههاي تشکیلدهنده شاخهچه در کشت بافت (پرآوري کم) و زمان طولانی مورد نیاز براي مرحله آغازش، کارآیی کمی دارد .(Amin, 2000) افزایش کشت بافتی به شیوه رویانزایی بدنی، زمان به نسبت کم و میانگین تولید بالا دارد. همچنین، مواد اولیه گیاهی میتواند هر زمان از سال کشت شود. اما، مهمترین عیب این روش، گذر از پینههاي رویانزا و افزایش آنهاست که احتمال رخ دادن جهش و غیرنرمالیها را در طول مرحله رشد گیاهچه در شرایط درون شیشهاي افزایش میدهد که ممکن است پس از کشت در مزرعه ظاهر شوند. مهمترین مزیت کشت بافت جوانههاي انتهایی، همسانی بسیار زیاد گیاهچههاي کشت بافتی در ویژگیهاي رویشی با گیاه مادري است. عیب این روش، مدت زمان طولانی براي به دست آوردن گیاهچههاي کشت بافتی و میانگین تولید پایین این روش است .(Amin, 2000) با این وجود، رویانزایی بدنی از نوك شاخسارههاي جدا شده از پاجوش با موفقیت انجام شده است .(Badawy et al. 2005)

به دلیل معایب این دو روش در افزایش خرما، یک روش جدید با استفاده از جوانههاي نابهجاي خرما استفاده شد که این روش به طور اساسی بستگی به باززایی جوانهها روي سطح ریزنمونههاي کشت بافت شده که به طور معمول تولید جوانه نمیکنند، دارد. هدف از به کارگیري یک تکنیک جدید، فراهم کردن روشهاي مختلف براي افزایش خرما و بهبود روشهاي به کار رفته موجود میباشد .(Amin, 2000) نخستین تلاشها براي کشت بافت خرما، توسط (1972) Reuveni صورت گرفت.

محیط کشت

مهمترین محیط کشت براي کشت بافت، محیط کشت Murashige و (1962) Skoog است که شامل ساکاروز به عنوان منبع انرژي (30gr/L)، فیتاژل (2/2gr/L)، ذغال فعال (3gr/L)، میواینوزیتول (100mg/L)، (10mg/L) 2,4-D ، 2ip (3mg/L)، (170mg/L ) NaH2PO4 و گلوتامین (200mg/L) میباشد .(Taha et al., 2007) سلولهاي گیاهی در کشت به ویتامینها به ویژه، تیامین (B1)، نیکوتینیک اسید، پانتوتنات پیریدوکسین (Pyridoxine pantothenate)، فولات (Folate) و بیوتین (H) نیازمندند. ویتامینها، به میزان بسیار کم براي افزایش رشد مورد نیازند. تیامین مهمترین فاکتور در متابولیزم کربوهیدراتها و بیوتین در واکنش کربوکسیلاسیون نقش ضروري دارد .(Taha et al. 2007) اثرات مفید سیتریک اسید و آسکوربیک اسید روي پیشگیري از قهوهاي شدن ریزنمونهها نیز گزارش شده است .(Othmani et al. 2009) اثر سوکروز و پلی اتیلن گلایکول روي تشکیل رویانهاي بدنی بررسی شد. نتایج نشان داد که سوکروز درغلظت بالا 60) گرم در لیتر)، تولید رویانهاي بدنی را بهبود بخشید. همچنین، تولید رویانها با افزودن %5 پلی اتیلن گلایکول - 8000 افزایش یافت .(Alkhateeb, 2006) اثر تنظیمکنندههاي رشد روي پینهزایی و توسعه رویان در چندین رقم خرما مانند Ahmar، Amsekhsi، Tijib و Amaside بررسی شد . رقمهاي Ahmar و Amsekhsi پینهزایی بالایی نشان دادند در حالی که دو رقم دیگر میزان کمی پینه تولید کردند. 2,4-D توانایی خوبی براي پینهزایی نشان داد و اثر آن با افزودن بنزیل آدنین یا سولفات آدنین افزایش یافت . (Sane et al . 2012)

در آزمایش Taha و همکاران (Taha et al. 2002)، مشخص شد که در استفاده از ریزنمونههاي نوك شاخساره در مقایسه با سرآغازههاي برگی، میزان تشکیل پینه بالاتر بود که احتمالاً به دلیل مریستمی بودن این بافتها میباشد. در کل، استفاده از هورمون 2,4-D به میزان 10mg/L باعث افزایش میزان تشکیل پینه در هر دو ریزنمونه گردید. با این وجود، بهترین پینههاي رویانزا در هر دو ریزنمونه در محیط کشت بدون هورمون بهدست آمد. یکی از مهمترین مراحل در کشت بافت خرما، انتقال گیاهچههاي به دست آمده به محیط بیرون میباشد، که به دلیل سیستم ریشهاي قوي در طول مرحله پیش از انتقال در گیاهان کشت بافتی، موفقیت در این مرحله بالا میباشد. مشخص شده است که نوع و غلظت سیتوکینین روي درصد رشد و تشکیل جوانهها تاثیرگذار میباشد. در این پژوهش، نمونههاي کشت شده روي محیط کشت بدون سیتوکینین، هیچ پاسخی به تشکیل شاخساره ندادند. از سوي دیگر، کاربرد 2ip با غلظت 2mg/L به همراه 1mg/L بنزیلآدنین باعث بهترین پاسخ رشدي 80)٪) و بیشترین میزان تشکیل جوانه شد. اثرات مثبت GA3 روي طویل شدن شاخسارههاي تولید شده در کشت بافت، گزارش شده است. با افزایش غلظت، طول شاخساره افزایش یافت اما مقداري بدشکلی نیز گزارش شد. همچنین، گزارش شد که اکسینها نقش اساسی در ریشهدهی از طریق تحریک سرآغازههاي ریشه ایفا میکنند. طبق بررسیها، افزودن NAA در غلظت 0/5mg/L باعث افزایش میزان ریشهدهی 90) درصد) و طول ریشه گردید .(Khierallah et al. 2007)
رویانهاي سوماتیکی (پیکري)، میتوانند از نواحی مریستمی برگها یا از نوك شاخهها از طریق تشکیل پینه به دست آیند. تشکیل پینه در محیط حاوي 2,4-D 100mg/L، 2ip 3mg/L به همراه 3 گرم ذغال فعال صورت گرفته است. بر پایه گزارش Tisserat (1984)، جوانههاي شاخه روي محیط کشت غنی شده با NAA و BA پرآوري کردند، با این وجود، اشراقی و همکاران (Eshragh et al. 2005)، دریافتند که پینههاي رویانزا وقتی که به محیط کشت غنی شده NAA و 2ip منتقل شدند، به گیاهچههاي داراي ریشه و شاخه توسعه یافتند .(Gabr et al. 2010) اسلام و همکاران (Aslam et al. 2009)، در بررسی کشت بافت خرما رقم Khalas در دو محیط کشت مایع و جامد MS، دریافتند که بیشترین میزان تولید پینه در محیط کشت غنی شده با 25/54μM، 2,4-D میباشد. همچنین، بیشترین میزان باززایی شاخساره 85)٪)، تعداد شاخساره در هر ریز نمونه در محیط کشت جامد غنی شده با 7/8 میکرومول BAP بهدست آمد. بیشترین میزان ریشهدهی 87/34٪ در محیط کشت MS غنی شده با 24/6 میکرومول IBA به دست آمد. اتمانی و همکاران (Othmani et al. 2009)، در بررسی کشت بافت خرما رقم Deglet Bey و عوامل موثر بر آن، مانند آنتیاکسیدانتها، جاذبها و غلظتهاي اکسین 2,4-D، در محیط کشت MS غنی شده با 2,4-D 10mg/L، توانستند براي نخستین بار، یک پروتکل کارآمد براي تولید این رقم را طی یک مدت هشت ماهه ارائه دهند .(Othmani, 2009)

ژنتیک

رویانزایی بدنی به شدت وابسته به ژنوتیپ است (Mohan Jain, 2007) و افزایش نخل خرما، به طور معمول توسط رویانزایی بدنی (Somatic Embryogenesis) صورت میگیرد. نتایج یک پژوهش نشان داد که بین رقمهاي ‘Mishrig wad Khateeb’ و ’Mishrig wad Laggai’ از نظر زمان آغازش پینهزایی تفاوت وجود داشت و در رقم Mishrig wad ’Khateeb’ آغازش رویان دو هفته زودتر نسبت به رقم ’Mishrig wad Laggai’ رخ داد. همچنین، از نظر تعداد رویانهاي پیکري تشکیل شده، بین دو رقم تفاوت وجود داشت اما از نظر ریشهزایی تفاوتی دیده نشد ( El-Fatih and Hind .(Badereldin, 2010 آسموتا و همکاران (Asemota et al. 2010)، رویانزایی بدنی از ریزنمونههاي مریستم انتهایی برگ را روي چندین محیط کشت که در حال حاضر براي رویانزایی بدنی و براي افزایش رویشی خرما استفاده میشود و نیز چندین تنظیمکننده رشد، بررسی کردند. بالاترین پتانسیل باززایی پینه در ریزنمونههاي مریستم انتهایی دیده شد و به دنبال آن در ریزنمونههاي پائین برگ (leaf bases) و سپس ریزنمونههاي برگ. در همه محیط کشتها، رویانزایی بدنی انگیخته شد اما محیط کشت داراي 0/05 میلیگرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر 2ip بهترین نتایج را به دنبال داشت و رویانها به آسانی، تولید شاخساره کردند و در محیط کشت داراي NAA و غلظت 45 -90 گرم در لیتر سوکروز ریشهها تولید شدند.

پژوهشها نشان داده است که رقم در تحریک تولید پینه و رویانهاي بدنی تاثیرگذار میباشد. همچنین، غلظتهاي معین ترکیبات مختلف تنظیم کنندههاي رشد در تحریک تولید پینه در رقمهاي مختلف خرما موثر میباشند. علاوهبراین، مشخص شده است محیط کشتی که در رقم ’Khanizi‘ تولید پینه رویانزا کرده بود روي رقم ’Mordasing‘ اثرات متفاوتی دارد. ترکیب محیط کشت و زمان براي رویانزایی بدنی در خرما از رقمی به رقم دیگر متفاوت میباشد .(Eshraghi et al. 2005) Shabana و همکاران (1994)، در مقایسه بین میوههاي درختان خرماي تولید شده به شیوه کشت بافت و پاجوش، گزارش کردند که این میوهها از نظر ویژگیهاي شیمیایی و فیزیکی با یکدیگر تفاوتی ندارند.

پروتوپلاستهاي توانمند (Totipotent protoplasts)، براي بهبود ژنتیک گیاهان کارا هستند. در رقمهاي ‘Deglet ‘ Nour و ’Takerboucht’، پینهها از ریزنمونههاي نوك شاخساره انگیخته شد و از این پینههاي ترد و زردرنگ، پروتوپلاستها جدا شذند. این پروتوپلاستها میتوانند در دستورزي ژنتیکی براي بهبود برنامههاي بهنژادي خرما به کار روند ( Chabane et

.(al. 2010

در یک مقایسه بین گیاهان تولید شده به شیوه کشت بافت و پاجوش در خرما، مشخص شد که بین این دو روش تفاوتی در ویژگیهاي رویشی (ارتفاع گیاه، تعداد برگ، قطر تنه) و عملکرد وجود ندارد و به دلیل مزایاي تکنیک کشت بافت (صرفهجویی در زمان، کاهش خطر انتشار بیماريها و حشرات، تولید گیاهان یکنواخت، قدرت استقرار بالا)، این روش را میتوان براي افزایش تجاري و انبوه خرما به کار برد .(Hajian, 2007)

سودمنديهاي استفاده از تکنیک کشت بافت

-1 تولید تعداد زیاد گیاه با کیفیت از یک گیاه -2 تولید گیاهان خرماي عاري از بیماري -3 آسانی حمل و نقل خرماهاي کشت بافت شده

-4 رشد سریع و زنده مانی بالاي خرماهاي کشت بافتی به دلیل سیستم ریشهاي قوي -5 پیشرفت ژنتیکی خرما، براي نمونه افزایش مقاومت به تنشهاي محیطی و بیماريها از طریق کشت سلول و پروتوپلاست،

جهش کشت بافتی و انتقال ژن تکنیکهاي کشت بافت افزون بر این مزایا، داراي چالشهایی نیز میباشند که در زیر به آنها پرداخته میشود و میبایست

پروتکلهاي کشت بافتی براي کاهش مشکلات بهبود یابند.

مشکلات مربوط به تکنیکهاي کشت بافتی

وقوع غیرنرمالی وابسته به مناطق خاصی نیست و نگرانی براي همه مناطق کشت خرما وجود دارد که غیر نرمالیها در برخی ارقام خاص، ممکن است اثرات شدیدي روي پرورش دهندگان خرما داشته باشد. مک کوبین و همکاران ( McCubbin (et al . 2000، فاکتورهاي زیر را در ایجاد تغییر در گیاهان کشت بافت شده، موثر دانستند:

(1 تولید پینه گیاهی به عنوان یک مرحله میانی از تولید، (2 ناپایداري ژنتیک مواد گیاهی مادري که شامل بافت ناهمسانی (Chimera) میشود. براي مثال گیاه مادري خرما باید محصول تولیدي آزمایش شده داشته باشد و از باغهاي خرمایی منشاء گرفته باشند که تکنیکهاي عملی مناسب در آن به کار میروند، (3 نوع و غلظت تنظیم کنندههاي رشد، مثل اکسینها و سیتوکینینها که در فرآیندهاي کشت بافت به کار میروند، (4 نوع نمونههاي گیاهی استفاده شده براي افزایش، زیرا احتمال وجود یک شیب چندگانی (پلوییدي) از زیر نوك به سمت ریشه یک گیاه وجود دارد، (5 تعداد نمونههاي زیر کشت شده که در افزایش استفاده میشوند، براي نمونه، یک کشت طولانی روي محیط کشت حاوي تنظیم کنندههاي رشد، ممکن است متابولیزم هورمونی نرمال سلولهاي کشت شده را مختل کند، (6 ترکیب مواد غذایی محیط کشت استفاده شده و (7 شرایط محیط کشت به کار برده شده (محیط کشت جامد یا مایع).

قهوهاي شدن (Browning) بافتهاي کشت شده

این پدیده به دلیل تغییرات فیزیولوژیکی درون بافتهاي کشت شده میباشد که منجر به قهوهاي شدن تدریجی و سرانجام مرگ بافتها میگردد. رنگ قهوهاي ظاهر شده به دلیل اکسید شدن ترکیبات فنولی درون بافتها میباشد. کشت بخشهاي گیاهی در فصل زمستان و بهار و افزودن زغال فعال به محیط کشت می توانند این پدیده را کاهش دهند ( Alkhateeb, .(2008 همچنین، آسکوربیک اسید پیش از تیمارهاي استریل کردن سطحی و کشت روي محیط کشت MS شامل 3mg/L ذغال فعال، بهترین روش براي جلوگیري از این پدیده بیان شده است Othmani .(Taha et al. 2007) و همکاران (2009)، در بررسی کشت بافت یک رقم خرما؛ براي جلوگیري از قهوهاي شدن، از ریزنمونههاي جوان استفاده کردند. آنها گزارش کردند که بیشترین ترکیبات قهوهاي کشنده، در مرحله آغازش تولید میشوند که به دلیل اکسید شدن ترکیبات فنولیک و تجمع کوئینینهاست که براي بافتها سمی محسوب میشوند. همچنین، در پژوهشی (Abd-El Kariem, 2009)، افزودن اکتینومایسین S. chloramphenicol در غلظت500 میلیگرم در لیتر به محیط کشت، باعث تولید بیشترین میزان گیاهان عاري از آلودگی باکتریایی، افزایش درصد بقا ریزنمونهها، بیشترین میزان رویانزایی و قدرت رشد شد.

شیشهاي شدن (Vitrification) بافتها

شیشهاي شدن، به دلیل تجمع آب درون بافتها می باشد که باعث کاهش رشد بافت و سرانجام مرگ آن میگردد. از عوامل موثر در ایجاد این پدیده میتوان به استفاده از محیط کشت مایع، غلظت بالاي هورمونهاي گیاهی و یا آمونیوم، سطح بالاي رطوبت و گازها به ویژه اتیلن در کنار بافتها اشاره کرد. استفاده از محیط کشت جامد، کاهش غلظت هورمونها و آمونیوم و افزایش غلظت آگار، در کاهش میزان این پدیده موثر میباشند .(Alkhateeb, 2008)

آلودگیهاي باکتریایی و قارچی

آلودگیهاي باکتریایی و قارچی، مهمترین مشکل در طول مراحل کشت بافت میباشند و اغلب 2 تا 4 ماه پس از کشت ظاهر میشوند. تمیز کردن بافتهاي آلوده با آب مقطر و آنتیبیوتیک پیش از کشت، ضدعفونی کردن ابزارها، استفاده از بافتهاي جوان براي کشت و کشت در فصلهاي زمستان و بهار باعث کاهش میزان این آلودگیها میگردد (Alkhateeb, .2008) ضدعفونی مناسب ریزنمونه، نوع ریزنمونه و تنظیم کنندههاي رشد گیاهی نقش مهمی را در ریز افزایی خرما بازي میکنند .(El-Kazzaz et al. 2000)

ریشهدهی زود هنگام بافتهاي جوانههاي کشت شده

ریشهدهی زود هنگام جوانهها؛ با اختصاص بیشتر مواد غذایی بافتها به تشکیل ریشه نسبت به تشکیل شاخساره، باعث کاهش توانایی افزایش جوانهها در طی مراحل کشت بافت میگردد. کاهش غلظت اکسینها به ویژه NAA میتواند باعث
کاهش این پدیده شود .(Alkhateeb, 2008)

گرده افشانی ناموفق و میوهدهی غیرنرمال

گرده افشانی ناموفق و تشکیل بسیار کم میوه، به روشنی در گیاهان رقم Barhee مشاهده شده است. (2000) Djerbi و همچنین مک کوبین و همکاران (McCubbin et al. 2000)، گزارش کردند که عدم گردهافشانی یک فرآیند غیر نرمال در گیاهان Barhee به دست آمده از رویانزایی بدنی است که این پدیده در تعدادي از نخلستانهاي Barhee در سراسر جهان شامل آفریقاي جنوبی، عربستان و امارات متحده عربی دیده شده است. براساس مشاهدات (2000) Djerbi، این پدیده همچنین در برخی مناطق عربستان در رقم Barhee و تا حد کمتري در ارقام Khlass و Deglet Nour وجود دارد. این پدیده در بیش از 100 اصله نخل کشت شده در سال 1990 هم پیدا شد. در همه ي خوشههاي گرده افشانی شده، 80 تا 100٪ میوهها پارتنوکارپ بوده و در برخی اوقات بیش از 3 برچه داشتند. این پدیده به مقدار زیادي در گیاهان خرماي انتقال داده شده در سال هاي 1994 و 1995 دیده شد که درختان نخل خرما میوهدهی غیر نرمال نشان دادند. نتایج مشابهی در رقم Barhee که به شیوه رویانزایی بدنی تولید شده بودند، توسط مک کوبین و همکاران (McCubbin et al. 2000)، پس از بررسی مزرعهاي گیاهان در آفریقاي جنوبی گزارش شد.