بخشی از مقاله
مطالعه ترانسکریپتوم نوك ریشه موتانت GmCLVATA1A سویا
چکیده
ژن CLAVATA1 (CLV1) در گیــاه مـدل آرابیدوپسـیس نقـش بســیار مهـم و کلیـدي در نگهـداري ســلول هـاي بنیـادي نــوك شــاخه و ریشــه بــازي مــی کنــد. در گیــاه ســویا دو ژن GmNARK و GmCLAVATA1A (GmCLV1A) ژنهــاي بــا تشــابه
بســـیار بـــالاژنبـــا CLV1 هســـتند. GmNARK در ســـویا نقـــش اساســـی در کنتـــرل غـــده زایـــی از طریـــق فراینـــد Autoregulation of Nodulation بــازي مــی کنــد. ولــی نقــش ژن GmCLV1A کــه تشــابه بــالایی بــا )GmNARKدر
دارد حــدود 92 درصــد) در ریشــه مشــخص نیســت. در ایــن مطالعــه تراســکریپتوم نــوك ریشــه موتانــتتیــپGmclv1a و
وحشـی بـا روش جدیـد RNA-Seq یـا همـان deep sequencing مقایسـه شـد تـا اطلاعـاتی را بـروي نقـش ایـن ژن در ریشـه
فراهم آورد. نـوك ریشـه بعـد از 48 سـاعت بعـد از حوانـه زنـی در تـاریکی برداشـت گردیـد. حـدود 1204 ژن بیـان متمـایزي از خــود نشــان دادنــد کــه در ایــنو میــان 777 ژن افــزایش 427 ژن کــاهش بیــان را نــوك ریشــه Gmclv1aـان نشـ دادنــد. آنــالیز MAPMAN نشان داد که بسیاري از این ژن ها در مسیر هاي مولکولی متابولیسم ، سیگنالینگ و توسعه نقش دارند.
کلمات کلیدي: سویا، ترانسکریپتوم، نوك ریشه، RNA-seq، لگوم
مقدمه
ســویا (Glycine max(L .) Merr) یکــی از گیاهــان مهــم خــانواده لگومینــوز مــی باشــد کــه نقــش مهمــی را در تــامین غــذا و علوفه جهـان بعـد از گیاهـان خـانواده غـلات ماننـد گنـدم، بـرنج و ذرت ایفـا مـی کنـد. حـدود یـک سـوم پـروتئین تغذیـه اي و روغــن گیــاهی فــرآوري شــده بــراي مصــارف انســانی بوســیله ســویا و ســایر گیاهــان خــانواده لگومینــوز تولیــد مــی شــود. از
آنجاییکه سویا متعلق به خانواده لگومینوز اسـت ایـن گیـاه هـم ماننـد سـایر گیاهـان ایـن خـانواده قـادر بـه برقـراري همزیسـتی بـا نـوعی بـاکتري خـاکزي بنـام Bradyrhizobium اسـت کـه باعـث تثبیـت بیولـوژیکی ازت مـی شـود .(3) تثبیـت بیولوژیـک ازت
از نظر اکولـوژیکی و اقتصـادي داراي اهمیـت بـالایی اسـت زیـرا تثبیـت بیولوژیـک ازت توسـط گیـاه منجـر بـه تقویـت خاکهـاي زراعی و هم چنین کاهش مصرف کود هاي ازته و در نتیجه کاهش آلودگی هاي زیست محیطی می شود.
مریستم هاي انتهایی که شامل مریستم نـوك شـاخه و مریسـتم نـوك ریشـه مـی شـود مسـئول رشـد هـوایی و زمینـی گیاهـان مـی باشــند. در ایــن نــواحی جمعیتـی از ســلول هــاس بنیــادي وجــود دارد کــه ایــن وظیفــه را بــر عهــده دارنــد. بنــابراین نگهــداري
جمعیتی از این سلول براي گیـاه بـه منظـور حفـظ رشـد خـود بسـیار مهـم مـی باشـد. بـا مطالعـات انجـام شـده در آرابیدوپسـیس
بخـوبی نقـش شـبکه ژنـی CLVدر نگهـداري سـلول هـاي بنیـادي نـوك شـاخه و ریشـه مشـخص شـدهـناسـت، .(4 1) در ایـ میــان نقــش ژن CLV1 کلیــدي مــی باشــد. در ژنــوم ســویا دو ژن بســیار مشــابه بــا ایــن ژن وجــود دارد: GmNARKو
.GmCLV1A
١
ژن GmNARK نقــش کنتــرل و تنظــیم غــده زایــی از طریــق پروســه Autoregulation of Nodulation (AON)را بــازي می کند بطوریکـه نقـص ژنتیکـی در ایـن ژن منجـر بـه تشـکیل غـده هـاي بسـیار بـر روي ریشـه مـی شـود. ژن GmCLV1A بـه
نظـر مـی رسـد کـه در مریسـتم انتهـاي شـاخه و سـاختار هـوایی گیـاه نقـش داشـته باشـد. ایـن دو ژن علـی رغـم تشـابه بـالاي
ژنتیکی حدود 92 درصد قادر به جبران نقص یکدیگر نیستند، .(3 2)
با این وجـود شـبکه ژنـی CLV در سـویا بـه خـوبی مطالعـه نشـده و نقـش ژن GmCLV1A در ریشـه مشـخص نیسـت. در ایـن
مطالعه تراسکرپتوم نوك ریشـه موتانـت Gmclv1a سـویا و مقایسـه آن بـا تیـپ وحشـی بـه منظـور روشـن کـردن نقـش ایـن ژن در ریشه و فرایند غده زایی مورد مطالعه قرار گرفت.
مواد و روش ها
شرایط رشد گیاه
بذر سـویا رقـم فارسـت1 و موتانـت Gmclv1a در تحقیـق مـورد اسـتفاده قـرار گرفـت. بـذور ابتـدا بصـورت سـطحی بـا اتـانول
70 درصـد ضـدعفونی و 5 مرتبـه بـا آب مقطــر اسـتریل آبکشـی گردیدنـد. سـپس بـذرها بـین کاغـذ صـافی درون پتـري دیـش2
قـرار گرفتنـد و درون اتاقـکـاي رشـد3 در دمـ 25 درجـه و تـاریکی نگهـداري شـدند. بعـد از گذشـت 48 سـاعت نـوك ریشـه
نمونه ها با استفاده از یک تیغ استریل برداشت و بلافاصله در ازت مایع فریز گردید.
استخراج RNA
بــراي انجــام RNA-seq، RNA کــل4 نــوك ریشــه بــا اســتفاده از کیــت اســتخراج RNA کمپــانیQiageneطبــق دســتورالعمل مربوطـه انجـام شـد و عملیـات حـذف DNA بـر روي سـتون انجـام شـد. کتابخانـه cDNA بـا اسـتفاده از کیـت Truseq RNA
کمپـانی Illumina انجـام شـد و تـوالی یـابی RNA توسـط مرکـز تحقیقـات ژنـوم اسـترالیا و بوسـیله Illumina HiSeq 2000
انجام شد.
بیوانفورماتیک و آنالیز داده ها
کیفیـت قطعـات تـوالی یـابی شـده5 بـا اسـتفاده از نـرم افـزار FastX tool kit انجـام شـد. سـپس قطعـات تـوالی یـابی شـده بـا اســتفاده از نــرم افــزار CLC Genomics workbench بــروي ژنــوم ســویا جایــابی6 شــدند. در نهایــت ژن هــاي کــه بطــور
متمایزي بیان شده بودند با مقایسه میزان بیان ژن ها در تیپ وحشی و نمونه موتانت تعیین شدند.
نتایج و بحث
به منظور درك اینکه ایـن ژن چگونـه بیـان ژن هـا را تحـت تـاثیر قـرار مـی دهـد پروفایـل بیـان ژن هـا در نـوك ریشـه موتانـت Gmclv1a و تیـپ وحشـی در مرحلـه جوانــه زنـی مـورد مقایسـه قـرار گرفـت. تـوالی هـاي 100 جفـت بـازي تولیـد از نمونــه
هـاي نـوك ریشـه بوسـیله Illumina HiSeq 2000 از کیفیـت بـالایی برخـوردار بودنـد و نتیجـه جایـابی آنهـا بـر روي ژنـوم
