بخشی از مقاله
چکیده
خانواده کدوییان یکی از مهمترین و بزرگترین خانوادههاي شناخته شده در سراسر جهان میباشد. در مقایسه با گونههاي مهم این خانواده از جمله Citrullus، Cucumis، Cucurbita و Momordica، گیاه دارویی هندوانه ابوجهل داراي سطوح بالاتري از آنتیاکسیدان بوده که در پیشگیري از بیماريهاي قلبی عروقی، دیابت و سرطان مفید است.
توالییابی RNA، براي مطالعات ژنتیکی ترانسکریپتوم گیاه دارویی هندوانه ابوجهل با استفاده از بنسازه Iluumina HiSeq2500 اجرا گردید. خوانشهاي خام با استفاده از نرمافزارهاي FastQC و Trimmomatic کنترل کیفیت شده و خوانشهاي داراي کیفیت بالا با تعداد 150،238،22تولید کرد. خوانشها با استفاده از برنامهي نوپدید یکپارچهسازي شده که تعداد 311،55 تکژن حاصل گردید.
تکژنهاي یکپارچه شده هندوانهي ابوجهل با استفاده از بلاست ایکس علیه پنج گونهي خانواده کدوییان از جمله هندوانه گرد - Clan - ، هندوانه چارلستون گري - WCG - ، خیار چنبر تلخ - Mcha - ، خیار چینی بلند - Csat - و خربزه - Cmel - با احتمال خطاي کمتر از یکصد هزارم بلاست شدند. ترسیم نمودار Venn از نتایج بلاست ایکس علیه ژنومهاي مختلف با استفاده از نرمافزار Venny صورت گرفت.
نتایج بلاست پوشش گسترده ترانسکریپتوم هندوانه ابوجهل را نشان داد. ادغام نتایج حاصل از ژنوم مرجع گونههاي خانواده کدوییان مانند هندوانه گرد، هندوانه چارلستون گري، خیار چنبر تلخ، خیار چینی بلند و خربزه تعداد 533،32 تکژن را به اشتراك گذاشتند.
تکژنهاي شناسایی شده در این تحقیق، درصد تفسیر بالاتري علیه ژنوم مرجع هندوانه چارلستون گري - WCG - در مقایسه با ژنوم مرجع سایر گیاهان خانواده کدوییان داشت. سطوح شباهت ژنی میتواند با هدف پیشبرد ایجاد ژنوم مرجع هندوانه ابوجهل، درك مکانیسمهاي تکاملی گسترش یا ادغام خانوادههاي مهم ژنی و حفاظت تکاملی بین گونهاي در مطالعات ژنتیکی و دستافزار کار بهنژادگران مورد استفاده قرار بگیرد.
مقدمه
گیاهان دارویی از زمانهاي گذشته در سراسر دنیا به عنوان منابع مواد زیستی فعال و درمانی با اهداف صنعتی و کشاورزي مورد استفاده قرار گرفتهاند
از سوي دیگر از نظر منابع ژنتیکی گیاهی، اطلاعات دقیقی که در مورد ژنهاي مفید، مانند ژنهاي مقاومت در برابر تنشهاي زیستی، غیرزیستی و ژنهاي مسئول متابولیتهاي ثانویه که معمولا در بخشهاي مختلف گیاهان متنوع یافت میشوند وجود دارد، که منجر به استفاده بهتر از ژنتیک گیاهی میشود .
خانواده کدوییان - Cucurbitaceae - دومین خانواده بزرگ باغبانی از نظر اهمیت اقتصادي پس از سیبزمینیان - Solanaceae - است. در این خانواده حدود 110 جنس و 560 تا 850 گونه وجود دارد. جنسهاي مهم از جمله Benincasa، Citrullus، Cucumis، Cucurbita، Luffa و Momordica به عنوان میوهجات و سبزیجات مورد استفاده قرار میگیرند و اکثر آنها داراي ارزش اقتصادي قابل توجه هستند. تعداد کروموزومها در قبیلهي Cucurbiteae تمام گونههاي جنس n=20 Cucurbita بوده، در حالیکه گونههاي قبیلهي Benincaseae که شامل جنس Cucumis و Citrullus هستند، ساختمان کروموزومی متفاوت n=13 - خربزه - ، n=12 - هندوانه - یا n= 7 - خیار - دارند
ین خانواده گیاهی بزرگ بهطور گسترده در مناطق گرم، نیمهگرمسیري و معتدل در جنوب، جنوبشرقی، شرق آسیا، آفریقا از جمله ماداگاسکار و مرکز آمریکايجنوبی توزیع شده است
هندوانه ابوجهل - Bitter Apple - با نام علمی Citrullus colocynthis گونهاي از گیاهان دارویی خانواده کدوییان، بهطور طبیعی با محیطهاي خشک و بیابانی سازگار است. این گیاه دارویی بومی نواحی گرم آفریقا، آسیا و منشا اولیه آن مجمعالجزایر واقع در نواحی جنوبی بوتان میباشد
از خواص درمانی گیاه در طب سنتی و مدرن میتوان ویژگیهاي ضد التهابی، آنتیاکسیدان، کاهنده چربی، دیابت و سرطان را نام برد . - Al-Snafi, 2016 - چندین ماده شیمیایی فعال گیاه هندوانه ابوجهل از جمله آلکالوئیدها، فلاونوئیدها، تاننها، ترکیبات فنولیک، ترپنوئیدها، کلوسینتوسیدها و گلیکوزیدها ثبت شده است
توالییابی RNA یکی از پیشرفتهترین تکنیکهاي توالییابی داراي راندمان بالا - High-Throughput Sequencing-HTS - شناخته شده است. از کاربردهاي مهم RNA-Seq تعیین ساختار رونوشت ژنها، مطالعهي الگوهاي پردازش RNA و تغییرات پس از رونوشت، شناسایی چند شکلیهاي تکنوکلئوتیدي - SNP - و آنالیز کمی بیان ژنها میباشد . توسعهى تکنولوژي توالییابی نسل جدید - NGS - ، باعث کاهش هزینه و به دنبال آن افزایش سرعت بازدهی توالییابی شده است
آنالیز ترانسکریپتوم به عنوان یکی از مراحل بنیادي در مطالعات بیولوژیک از جمله تفسیر عملکرد عناصر ژنومی و آشکارسازي مولکولهاي سلولی و بافت یک رویکرد مناسب براي تسریع کشف ژنها و روابط فیلوژنتیک میباشد
یک پایگاه داده تفسیر ژن یکپارچه شده داراي پوشش جامع دادهها به عنوان گام اول از هر الگوریتم تحلیل کاربردي ژن با کارایی بالا ضروري است. برخی از پایگاههاي داده یکپارچه مانند NCBI Entrez Gene، UniProt و PIR تلاش زیادي براي ادغام منابع تفسیر در یک مکان متمرکز انجام دادند و به عنوان پایه و اهداف بیوانفورماتیک در سطح جهانی مورد توجه قرار گرفتهاند
بلاست یا ابزار جستوجوي همترازي بر پایه محلی - BLAST: Basic Local Alignment Search Tool - مجموعه گستردهاي از برنامههایی است که براي پیدا کردن مناطق محلی مشابه بین توالیها، از جمله تفسیر ESTs یکپارچه شده از توالییابی ترانسکریپتوم موجودات داراي ژنوم ناشناخته استفاده میشود. به طور معمول، بلاست میتواند میزان حفاظت تکاملی را در میان گونهها تعیین کرده و یا به طور متناوب الگوهاي بیان بین آنها را مقایسه کند.
در حالیکه تلاشهاي زیادي در توسعه نرمافزار یکپارچهسازي، تفسیر داده و تحلیل بیان انجام شده است، تحقیقات پس از آن مانند مقایسههاي ترانسکریپتوم کامل بسیار کمتر است. Venny یک نرمافزار یکپارچه و کاربر پسند که ترکیبی از یک ابزار سریع بهینهسازي بلاست و مقایسه همترازي ترانسکریپتوم کامل میباشد؛ نتایج را در نمودار شهودي Venn ترسیم کرده که روابط مجموعه ساده بین تعداد مقایسههاي بلاست را نشان میدهد.
Venny چشمانداز بالهاي از ارتباط تکاملی ترانسکریپتومهاي کل را فراهم کرده، قادر است ژنها را به زیرگروههاي معنیدار تجزیه کند که بعدا میتواند با استفاده از ابزارهاي مختلف تجزیه و تحلیل شود. براي کمک به تجزیه و تحلیل بلاست، اغلب از نمودار Venn استفاده میشود. هر مجموعه داده با یک منحنی بسته نمایش داده شده و هر مجموعه با یکی از روابط فضایی بین منحنی نمایانگر میشود.
هر دو منحنی و روابط فضایی آن اغلب به راحتی قابل مشاهده هستند. بنابراین، نمودار Venn به راحتی روابط مجموعه دادهها، توانایی آنها یا سایر اطلاعات کمی مرتبط را نشان میدهد و همچنین چند ضلعیهاي کوچک میتوانند تجزیه و تحلیل کلکسیونی از مجموعه دادهها را براي ویژگیهاي مختلف تسهیل کنند به عنوان مثال، نمودارهاي Venn نشاندهندهي همپوشانی ژنها در گیاهان مختلف مانند خربزه - Clepet et al., 2011 - - Cucumis melo - ، پسته - Moazzam Jazi et al., 2017 - - Pistacia vera - ،کدوي تخم کاغذي - Montero-Pau et al., 2018 - - Cucurbita pepo - ، انار - Yuan et al., 2018 - - Punica pranatum - و زنیان - Soltani Howyezeh et al., 2018 - - Trachyspermum ammi L. - میباشند.
توالییابی ترانسکریپتوم با توان بالا، مسیر را براي مطالعه اطلاعات ژنتیکی و عملکردي ذخیره شده در هر موجود در مقیاس و سرعت بیسابقهاي باز نموده است. هندوانه ابوجهل به عنوان یک محصول دارویی مهم اطلاعات ژنتیکی ترانسکریپتومی محدودي دارد، بنابراین دادههاي توالی ترانسکریپتوم یکپارچه و تفسیر شده براي ایجاد ژنوم مرجع هندوانه ابوجهل براي مطالعات ژنتیکی آینده در این گونه استفاده میشود. ترانسکریپتوم پیشبینی شده و اطلاعات مقایسهاي ارائه شده، درك مکانیسمهاي تکاملی گسترش یا ادغام خانوادههاي مهم ژنی، مانند ژنهاي متابولیتهاي ثانویه در هندوانه ابوجهل را تسهیل میکند.
مواد و روشها
نمونهي میوه سبز از یک بوتهي گیاه دارویی هندوانه ابوجهل جمعآوري شد. بعد از نمونهگیري بلافاصله آن را در ازت مایع قرار داده و به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده کشاورزي و منابع طبیعی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهواز منتقل کرده و تا زمان استخراج RNA در فریزر با دماي -80 درجه سانتیگراد نگهداري شد. از نمونهي گیاهی، RNA کل با استفاده از کیت کیاژن مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شده و پس از ارزیابی کیفیت نمونهي RNA با استفاده از ژل آگارز یک درصد و اسپکتروفتومتر نانودراپ، نمونه براي توالییابی به موسسه ژنومی چین - BGI - ارسال گردید.
توالییابی به صورت خوانشهاي دو طرفه 2×150 با استفاده از بنسازه Illumina HiSeq2500 انجام شد و کیفیت خوانشهاي خام با استفاده از نرمافزارهاي FastQC - ورژن - 0,10,1 و Trimmomatic - ورژن - 0,32 کنترل و مورد تایید قرار گرفت. به دلیل عدم وجود ژنوم مرجع گیاه هندوانه ابوجهل، یکپارچهسازي نوپدید - Assembly de novo - ترانسکریپتوم با استفاده از نرمافزار اجرا شد.
در نهایت براي تفسیر تکژنهاي یکپارچه هندوانهي ابوجهل با استفاده از بلاست ایکس - براي توالیهاي نوکلئوتیدي - علیه پنج پایگاه داده ژنوم گیاهی هندوانه گرد - Clan: Citrullus lanatus - ، هندوانه چارلستون گري - WCG: Citrullus lanatus subsp. Charleston Gray - ، خربزه - Cmel : Cucumis melo - ، خیار چینی بلند - Csat: Cucumis sativus - و خیار چنبر تلخ - Mcha: Momordica charantia - با احتمال خطاي کمتر از یکصد هزارم بلاست شدند. تکژنهاي ژنوم گونههاي خانواده کدوییان در وبسایت - /gro.scimonegtibrucuc//:ptth - در دسترس هستند. براي ترسیم نمودار Venn از نرمافزار Venny - http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html - به منظور مقایسه شباهت ژنی استفاده شد
