بخشی از مقاله
چکیده
بهینه سازي باززایی پنبه با استفاده از ریزنمونه نوك شاخه براي ارقام رایج در ایران به منظور انتقال ژن ضروري بنظر میرسد. بدین منظور از نوكشاخههاي 4 روزه به همراه ساقه استفاده گردید و محیط کشت MS بعلاوه 100 میلیگرم در لیتر میواینوزیتول و 0/5 میلیگرم در لیتر از هر یک از ویتامینهاي اسید نیکوتینیک ، پیریدوکسین و تیامین با 30 گرم در لیتر ساکارز، منجر به 100 درصد باززایی و 5 درصد شاخهزایی گردید. به منظور تراریزش نوكشاخهها از نژاد LBA 4404 آگروباکتریوم حاوي پلاسمید PBI121 و حامل ژن هاي مقاومت به کانامایسین - nptII - و ژن گزارشگر gus استفاده شد.
نوك شاخهها در سوسپانسیون حاوي آگروباکتریوم به مدت 10،20، 30 و 40 دقیقه تلقیح و به مدت 3 روز در تاریکی همکشت شدند و سپس به محیط کشت باززایی انتقال یافتند. با انتخاب برگهاي گیاهان مشکوك به تراریختی روي محیط انتخاب، صحت انتقال ژن gus با کمک PCR در تیمار مربوط به زمان 20 دقیقه تلقیح تایید شد. در مجموع نتایج این بررسی نشان داد که درصد تراریزش به نوكشاخه رقم ورامین 0/1 درصد بوده است که نشان دهنده پایین بودن میزان انتقال ژن در این رقم است.
مقدمه
پنیه - Gossypium hirsutum - یکی از مهمترین گیاهان لیفی در دنیا است که ارزش مواد اولیه آن 5/5 بیلیون دلار در سال می باشد - توحیدفر و همکاران،. - 2005 از جمله عواملی که باعث کاهش خصوصیات کمی و کیفی پنبه میشود خسارات ناشی از آفات، بیماريها و علفهاي هرز است. اگرچه اخیرا موفقیتهاي بزرگی به منظور تولید واریتههاي اصلاح شده پنبه از طریق روشهاي مرسوم اصلاح نباتات حاصل شده است، ولی این روشها بسیار زمانبر می باشند.
بنابراین به دلیل محدودیتهاي روشهاي اصلاحی سنتی، استفاده از تکنیکهاي بیوتکنولوژي از جمله کشت بافت و سلول گیاهی میتواند راهکاري جهت تسریع روشهاي اصلاحی باشد - محمدي بازرگانی،. - 1383 پیشرفت در زمینه بیوتکنولوژي پنبه وابستگی شدیدي به نوآوري و ایجاد روشهاي موثر انتقال ژن و باززایی دارد. تهیه دستورالعملهاي باززایی موثر یکی از عوامل بسیار مهم در زمینه بیوتکنولوژي پنبه میباشد - گروسی و همکاران، 1386 و اوما1 و همکاران، . - 2004
مواد و روش: ابتدا بذور در کلریدجیوه 0/075 درصد به مدت 2 دقیقه ضدعفونی شدند، پس از شستشو با آب مقطر استریل، به مدت 15 ثانیه در الکل 96 درصد فرو برده و سپس با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. براي تهیه ریزنمونه نوكشاخه همراه با ساقه ابتدا برگهاي اولیه حذف و نوك مریستم به دو قسمت نامتقارن تقسیم شد سپس مریستم مورد نظر روي هیپوکوتیل به همراه قسمت کمی از ریشه باقی ماند. براي باززایی از محیط کشت هاي -1آب آگار، -2 محیط کشت ½ MS حاوي نصف غلظت نمکهاي MS و -3محیط کشت MS بعلاوه 100 میلیگرم در لیتر میواینوزیتول و 0/5 میلیگرم در لیتر از هر یک از ویتامینهاي اسید نیکوتینیک، پیریدوکسین و تیامین با 30 گرم در لیتر ساکارز استفاده گردید.
در این تحقیق از آگروباکتریوم تومفاشینس نژاد LBA4404 حاوي پلاسمید pBI121 داراي ژن گزارشگر gus و ژن گزینشگر nptII استفاده گردید. بعد از تهیه ریزنمونه مورد نظر، تلقیح ریزنمونه با سوسپانسیون باکتریایی با غلظت 0/6-0/8 و زمانهاي 10، 20، 30 و 40 دقیقه انجام شد. پس از سه روز همکشتی در تاریکی، ریزنمونه ها به محیط کشت باززایی منتقل گردید. پس از باززایی گیاهان، به منظور انتخاب گیاهان مشکوك، از هر کدام یک برگ تازه جدا و روي محیط کشت انتخاب حاوي 50 میلی گرم در لیتر کانامایسین کشت داده شد. آنالیز دادهها با استفاده از نرم افزار JMP انجام و مقایسه میانگین با روش چند دامنهاي دانکن صورت گرفت.
نتایج و بحث: یک هفته پس از کشت ریزنمونهها، نوكشاخهها به سرعت شروع به رشد کرده و بعد از یک هفته گیاه کاملی را تشکیل دادند - شکل. - 1 در هر سه محیط کشت، باززایی بخوبی انجام شد و در ابتدا تفاوتی بین سه محیط کشت دیده نشد اما با گذشت تقریبا 3 تا 4 روز از کشت، ساقههاي گیاهان روي محیط کشت آبآگار شروع به قهوها ي شدن و پژمردهشدن کردند و بعد از 4 روز بکلی از بین رفتند که انتظار میرود عدم وجود مواد غذایی کافی و ویتامینهاي مورد نیاز در محیط کشت آب آگار باعث از بین رفتن گیاهچهها باشد. جوانهزنی روي محیط کشتهاي دوم و سوم، 100 درصد بود اما روي محیط آب آگار 25 درصد نوكشاخهها رشدکردند و 75 درصد آنها از بین رفتند. شاخهزایی نیز مورد بررسی قرارگرفت.
گیاهچههاي باززایی شده روي محیط کشت ½ MS و آبآگار فقط یک شاخه تولید کردند اما روي محیط کشت سوم 5 درصد شاخهزایی مشاهده شد. رشد ریشه نیز در همان محیط سوم بخوبی دیده شد و تمام گیاهان رشدکرده مشکلی به لحاظ ریشهزایی نداشتند. بعد از دو هفته از رشد آنها فرایند سازگارشدن روي گیاهچهها صورت گرفته و سپس گیاهچهها به گلدانهاي حاوي خاك رس، شن و کود حیوانی به نسبت مساوي انتقال یافتند - شکل. - 2
اثر سوسپانسیون باکتریایی روي باززایی: با توجه به مقایسه میانگین دادههاي حاصل از تیمارهاي تلقیح 10، 20، 30 و 40 دقیقه روي باززایی ریزنمونهها، تفاوتی بین زمانهاي تلقیح در میزان باززایی مشاهده نشد و سوختگی ایجاد شده در انتهاي ساقه احتمالا بدلیل از بین رفتن قسمتهاي زخمی شدهي ساقه ها پس از غوطهوري با سوسپانسیون باکتریایی باشد که به نظر میرسد براي جلوگیري از این پدیده بهتر است فقط نوك شاخه با استفاده از یک سرنگ با سوسپانسیون باکتریایی آغشته شود.
تراریزش: پس از 4 هفته از کشت برگها روي محیط کشت انتخاب تنها 0/1 درصد از برگها روي محیط کشت انتخاب زنده ماندند - شکل. - 3 پس از استخراج DNAي آنها، صحت انتقال ژن gus به گیاه با مشاهده باند مربوط به ژن gus و عدم مشاهده باند مربوط به ژن vir باکتري در گیاه مربوط به تیمار 20 دقیقه تلقیح با سوسپانسیون باکتري تایید شد - شکل. - 4 این نتیجه نشاندهنده پایین بودن میزان انتقال ژن در این رقم با استفاده از ریزنمونه نوك شاخه است.
از عمده ترین دلایل سخت بودن انتقال ژن به نوك شاخه میتواند سه لایه بودن نوك شاخه پنبه باشد چراکه انتقال ژن صحیح به نوك شاخه منوط به برش صحیح نوك شاخه میباشد - جیانگ1، - 2004 بطوریکه لایه سوم یا داخلی ترین لایه در معرض سوسپانسیون باکتري قرار گیرد که در غیر اینصورت انتقال ژن موفقیتآمیز نخواهد بود. یولیان2 و همکاران - - 1988 درصد انتقال ژن gus به نوكشاخهي پنبه را 0/7 درصد گزارش کردند. همچنین سومیترا - 2008 - 3 در مطالعهي خود روي انتقال ژن به پنبه رقم کوکر درصد تراریزش پنبه با استفاده از ریزنمونهي نوكشاخه را 0/2 درصد گزارشکرد.
