بخشی از مقاله
چکیده
این مطالعه به منظور بررسی چندشکلی ژن CD 4 و مطالعه نقش آن در افزایش مقاومت به بیماری ورم پستان درگاوهای نژاد هلشتاین استان خراسان رضوی انجام گردید. نمونههای خون از 150 رأس گاو متعلق به شش گله، جمع آوری شد. استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته-کلروفورم انجام شد. یک قطعه 212 جفت بازی از این ژن که شامل اینترون شش بود، توسط واکنش زنجیرهای پلیمراز تکثیر شد. تعیین ژنوتیپ هر حیوان به روشSSCP با استفاده از الکتروفورز ژل پلیاکریلآمید 10 درصد انجام و سپس از نیتراتنقره برای رنگآمیزی استفاده شد؛ سه ژنوتیپ با فراوانی - AA - 0/1466، - BB - 0/2266 و - AB - 0/6266 مشاهده گردید؛ فراوانی آللهای A و B به ترتیب 0/46 و 0/54 بود. ارتباط چندشکلیها و صفت مورد مطالعه بوسیله رویهی مختلط نرم افزار SAS نسخه 9/1 ارزیابی شد. نتایج نشان داد که ناحیه مورد مطالعه چندشکل بوده و چند شکلیهای مشاهده شده با نمره سلولهای بدنی ارتباط معنیدار دارد - P< 0/0004 - ؛ لذا میتوان از آن به عنوان یک نشانگر بالقوه و مناسب به منظور بهبود وضعیت ورم پستان در صنعت گاو شیری استفاده نمود.
واژههای کلیدی: ژن - CD 4 نمره سلولهای سوماتیک- گاو هلشتاین- نشانگر ژنتیکی
مقدمه
بهبود شرایط سلامتی گله و افزایش مقاومت به بیماریها در حیوانات علاوه بر افزایش بازده اقتصادی گله، دارای مزایایی نظیر افزایش ایمنی خوراک انسان، کاهش مصرف آنتیبیوتیکها و افزایش آسایش حیوانات نیز میباشد . - 1 - انتخاب حیوانات برای افزایش مقاومت به ورمپستان و کاربرد روش گزینش به کمک نشانگرهای ژنتیکی، فرصت مناسبی را برای بهبود وضعیت ورم پستان در صنعت گاو شیری فراهم کرده است . - 2 - ژن 1CD4 - مجموعه تمایزی - 4 از جمله ژنهای مؤثر بر ایمنی سلولی در گاو است که بر روی کروموزوم پنج قرار گرفته و شامل هفت اگزون و شش اینترون میباشد. در اثر بیان این ژن یک گلیکوپروتئین غشایی به همین نام، بر روی سطح سلولهای ایمنی همچون سلولهای لنفوسیت کمکی T، مونوسیتها، ماکروفاژها و سلولهای دندریتیک تولید میشود. پروتئین CD4 و سلولهای T حاوی CD4 نقش مهمی را در مقاومت میزبان در طی پیشرفت ورم پستان ایفا میکنند . - 3 -
اهداف
این مطالعه به منظور بررسی وجود چندشکلی در ژن CD 4 گاو و در صورت وجود چندشکلی در مرحله بعد با هدف بررسی نقش چندشکلیها در ایجاد مقاومت در برابر بیماری ورمپستان درگاوهای نژاد هلشتاین استان خراسان رضوی انجام شد.
روش کار
در این پژوهش از تعداد 150 رأس گاو شیری متعلق به شش گله در استان خراسان رضوی خونگیری به عمل آمد. جهت استخراج DNA از پروتکل استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته-کلروفورم استفاده شد. در این مطالعه بخشی از اینترون شش از جایگاه ژنی CD4 انتخاب و یک جفت آغازگر اختصاصی20 نوکلئوتیدی توسط نرم افزار Primer3 طراحی شد. توالی این آغازگرها در جدول 1 آمده است.شرایط بهینه واکنش زنجیرهای پلیمراز 2 برای تکثیر نهایی قطعه مورد نظر با مطالعه گزارش دیگر محققین و استفاده از شرایط و غلظتهای مخلتف در حین آزمایش با آزمون و خطا و بررسی کیفیت قطعه تکثیر یافته، انتخاب شد. برای تعیین ژنوتیپ هر حیوان از روش 3PCR-SSCP و الکتروفورز ژل پلیاکریل- آمید 10 درصد استفاده و از نیتراتنقره برای رنگآمیزی استفاده شد؛ سپس بر اساس قرار گرفتن الگوهای باندی، ژنوتیپ حیوانات تعیین گردید. به منظور بررسی ارتباط چند شکلی ژن مذکور با نمرهسلولهای سوماتیک و بیماری ورمپستان از دادههای ثبت شده در تعاونی گاوداران خراسان وابسته به مرکز اصلاح نژاد استفاده شد. مدل آماری مورد استفاده عبارت بود از:
نتایج و بحث
نتایج حاصل از بررسی ارتباط چندشکلی در ژن CD4 با نمره سلولهای بدنی نشان داد که چندشکلی در این ژن با نمره سلولهای بدنی ارتباط معنیدار آماری دارد - P<0/0004 - ؛ دادههای حاصل از آنالیز این ارتباط در جدول2 آورده شده است.بر اساس اطلاعات موجود در NCBI در پایگاهEnsemble ، اینترون شش ژن CD4 به عنوان منطقه دارای چندشکلی معرفی شده است . - 7 - نتایج بدست آمده در مطالعه حاضر نیز نشان داد که در ناحیه مورد مطالعه چندشکلی وجود دارد. در نتایج حاصل از آنالیز SSCP این پژوهش همان طور که در شکل 1 آمده است سه الگوی باندی متفاوت مشاهده شد که بر اساس موقعیت آنها بر روی ژل، دو آلل A و B برای ژنوتیپهای ممکن ژن CD4 تعیین گردید. این ژنوتیپها شامل AA، BB و AB بود. مقادیر مربوط به فراوانی ژنوتیپها و فراوانی آللها در جدول 3 آمده است.
مطالعه هی و همکاران - 2011 - 1 نشان دادند که چندشکلیهای مشاهده شده در ژن CD4 اثر معنیدار آماری بر روی ارزش اصلاحی دام برای نمرهسلولهای بدنی در گاوهای هلشتاین چینی داشته است . - 3 - نتایج حاصل از مطالعه حاضر با نتایج مطالعه هی و همکارانش مطابقت داشت. مطالعات انجام شده توسط تورس و جانسون - 1998 - اهمیت سلولهای T دارای گیرنده CD4 در طول عفونت پستان استافیلوکوکوسی را نشان دادهاست . - 4 - سایر محققین از جمله تایلر2 و همکاران - 1997 - ، راگو اسکیلوِرت - 1998 - 3، سالتیس و کوئین - 1999 - و ریواز و همکاران - 2007 - نیز گزارشات مشابهی را در همین زمینه ارائه کردند 5 - ، 6، 7 و - 8؛ نتایج تحقیقات برخی محققان نیز نشان داده که بروز اندک ژن CD4 در سطح سلولهای T، با کاهش تحریکات آنتیژنی منجر به اختلال در پاسخ ایمنی میگردد . - 9 -
