بخشی از مقاله
چکیده
بهمنظور بررسی اثر ایجاد ورمپستان با استفاده از لیپوپلیساکارید - LPS - ایشرشیاکولی، بر بیان ژنهای متابولیسمی پستان در دامهایی که با تزریق انسولین متابولیتها و هورمونها دستکاری شده بودند، تعداد 19 رأس گاو هلشتاین چند شکم زایش انتخاب گردید. دامها به صورت تصادفی به سه گروه تزریق انسولین n=6 - ؛ - HypoG، تزریق انسولین به همراه گلوکز n=5 - ؛ - EuG، و تزریق سرم فیزیولوژی n=8 - ؛ - Control به مدت 56 ساعت، اختصاص داده شدند. چهل و هشت ساعت پس از شروع تزریق، به میزان LPS 200 ʽg به دو تا از کارتیهها و سرم فیزیولوژی به دو کارتیه دیگر پستان تزریق گردید. یک هفته قبل، 48 ساعت و 56 ساعت پس از شروع آزمایش 8 - ساعت پس از تزریق - LPS از هر دو کارتیه نمونهبرداری شد. مقدار کمی بیان mRNA ژنهای متابولیسم پستانی با استفاده از روش qPCR اندازهگیری شد. تزریق متابولیتها در 8 ساعت پایانی آزمایش، بیان mRNA ژنهای EFL5 و INSR را در همه گروهها کاهش داد . - P<0.05 - تزریق داخل پستانی LPS، بیان mRNA ژنهای ELF5, ACoAC, SREBF1, FASN را در کارتیههای پستانی LPS نسبت به کارتیه کنترل کاهش داد . - P<0.05 - تزریق LPS سبب شد ژن GLUT1 در کارتیه LPS تمایل بیشتری به کاهش بیان mRNA نسبت به کارتیه کنترل داشته باشد - . - P=0.07 نتایج نشان داد ورمپستان بر متابولیسم پستانی و بخصوص سنتز شیر در دامهای پرتولید تأثیر منفی داشته و در حال حاضر ورمپستان به عنوان یکی از معضلات صنعت گاو شیری دارای اهمیت ویژهای میباشد.
کلمات کلیدی: لیپوپلیساکارید، متابولیسم، بیان mRNA، انسولین.
مقدمه
در سالهای اخیر دامهایی که از نظر ژنتیکی قابلیت تولید شیر بالایی دارند انتخاب شده و گسترش پیدا کردهاند. همزمان با انتخاب دامهای با تولید بالا خطر وقوع بیماریهای عفونی در این دامها افزایش پیدا کرده است. افزایش حساسیت نسبت به بیماریهای عفونی و همچنین سرکوب سیستم ایمنی در دو هفته اول زایمان در گاوهای پرتولید دیده شده است - Smith et - al., 1985 که بهنظر میرسد این امر ناشی از سازگاری متابولیکی بدن به تعادل منفی انرژی - NEB - در این دوران باشد - van . - Dorland, 2009; Zarrin et al., 2017 از مشخصههای بارز تعادل منفی انرژی در دامهای پرتولید و بخصوص در دوره انتقال کاهش غلظت گلوکز خون و به تبع آن افزایش آزادسازی اسیدهای چرب - FFA - از بافت های ذخیرهای چربی و بالا رفتن غلظت آنها در خون و نهایتاً به دلیل عدم توانایی کبد در تبدیل اسیدهای چرب به انرژی افزایش غلظت اجسام کتونی و بهخصوص بتاهیدروکسیبوتیرات - BHB - در خون می باشد . - van Dorland et al., 2009 ; Zarrin et al., 2017 - مشخص شده است که سیستم ایمنی در زمان NEB دچار اختلال شده و خطر ابتلا به بیماریهایی نظیر ورمپستان در دوره انتقال به بالاترین حد میرسد . - Ingvartsen, 2006 - وقوع ورمپستان بوسیله فاکتورهای مختلفی از جمله پاتوژنها، شرایط دامها، و شرایط محیطی تعیین میشود . - Burvenich et al., 2007 - از میان فاکتورهای دامی تغییرات فیزیولوژیکی میباشد که از جمله آنها میتوان به تغییر متابولیتها و هورمونها اشاره کرد که خطر ابتلا به این بیماری را افزایش میدهد. استفاده از لیپوپلیساکارید داخل پستانی - Intra-mammary LPS challenge - بهمنظور مشابهسازی عفونت داخل پستانی و ایجاد ورمپستان در دامها به منظور بررسی اثرات ورمپستان بر متابولیسم و پاسخ سیستم ایمنی و عملکرد دام توسط - Bruckmaier et al., 1993 - بنیانگذاری گردید. مطالعات زیادی اثرات را بر روی متابولیسم و بیان ژنهای مرتبط با سیستم ایمنی و
متابولیسمی را نشان دادهاند . - Waldron et al., 2006; Bruckmaier et al., 1993; Vernay et al., 2012; Zarrin et al., 2014b -
هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر ایجاد ورمپستان با LPS بر بیان برخی از ژنهای مرتبط با متابولیسم پستانی در دامهای که متابولیتهای خونی بوسیله تزریق دستکاری شده بودند میباشد.
مواد و روشها
تعداد 19 رأس گاو هلشتاین با شکم زایش 3/0 ± 0/1 و - Mean - SD - 28/0 ± 0/2 هفته بعد از زایمان برای انجام این آزمایش انتخاب شدند. دو هفته قبل از شروع آزمایش، دامها به جایگاههای انفرادی بهمنظور سازگاری با شرایط نگه داری و تغذیهای انتقال داده شدند. در طول دوره سازگاری و آزمایش، دامها بهصورت آزاد از علوفه خشک مرغوب تغذیه شدند.
علاوه بر آن بر اساس تولید هر یک از آنها کنسانتره دارای انرژی و پروتئین بالا بهصورت روزانه در اختیار آنها قرار گرفت و دامها بهصورت آزاد به آب دسترسی داشتند. گاوها بهصورت تصادفی به سه گروه اختصاص داده شدند که شامل: تزریق انسولین بهمنظور کاهش غلظت گلوکز خون به کمتر از n=6 - 2/5 mmol/L؛ - HypoG، تزریق انسولین ±0/1 mU/kg of BW - - 0/6 به همراه گلوکز بهمنظور ثابت نگهداشتن غلظت گلوکز خون در حد فیزیولوژیک و بررسی اثر افزایش غلظت انسولین بهتنهایی n=5 - ؛ - EuG، و تزریق سرم فیزیولوژی - %0/9 NaCl - بهعنوان گروه کنترل n=8 - ؛ - Control بودند. روز قبل از شروع آزمایش کاتاترهای داخل رگی به طول 32 سانتیمتر و قطر16 G در ورید گردنی دو طرف گردن نصب گردید. مدت زمان تزریق متابولیتها 56 ساعت بود که از ساعت 09:00 روز اول شروع و تا ساعت 17:00 روز سوم ادامه پیدا کرد. اطلاعات کامل مربوط به تیمارهای تزریقی، نحوه تنظیم تزریق، نمونهگیری خون، و اندازهگیری متابولیتهای خونی و هورمونها قبلاً به طور کامل شرح داده شده است . - Kreipe et al., 2011; Vernay et al., 2012; Zarrin et al., 2015 - چهل و هشت ساعت پس از شروع آزمایش، 200 ʽg از LPS Escherichia coli - # L8274 ; Sigma-Aldrich - به دو تا از کارتیهها به عنوان LPS quarter و محلول سرم فیزیولوژی %0/9 به داخل دو کارتیه دیگر بهعنوان کارتیههای کنترل تزریق گردید. یک هفته قبل از شروع آزمایش، 48 ساعت - قبل از تزریق - LPS و 56 ساعت پس از شروع آزمایش - 8 ساعت پس از تزریق - LPS از هر دو کارتیه بوسیله تفنگ بیوپسی نمونهبرداری صورت گرفت. جزئیات کامل استخراج RNA و نحوه طراحی پرایمرها و اندازه گیری کمی بیان ژنهای انتخابی با استفاده از روش qPCR در مقالات قبلی گزارش شده است . - Zarrin et al., 2014b - میزان تغییر هر کدام از ژنها محاسبه شد و براساس رویه GLM نرمافزار آماری SAS مورد ارزیابی آماری قرار گرفت و تفاوت میانگینها با استفاده از آزمون توکی مقایسه گردید. دادهها بهصورت - Mean - SD - بیان گردیده و P ≤ 0.05 بهعنوان سطح معنیداری در نظر گرفته شد.
جدول -1 تفاوت بین بیان mRNA ژنهای مرتبط با متابولیسم در پستان در زمان تحریک با LPS در کارتیه های کنترل و کارتیه های .LPS داده ها به صورت mean - SEM نمایش داده شده اند.
نتایج و بحث
همانگونه که در مقالات قبلی گزارش شد، ایجاد هایپوگلایسمی و افزایش غلظت انسولین بدون تغییر علظت گلوکز خون با استفاده از تزریق انسولین و انسولین همراه با گلوکز موفقیتآمیز بود . - Kreipe et al., 2011 ; Vernay et al., 2012 - این محققین تغییر متابولیتها و هورمونهای مختلف را در مدت 48 ساعت گزارش نمودند. همچنین در 8 ساعت انتهایی آزمایش و در طول مدت ایجاد ورمپستان با LPS سیستم متابولیسمی، تغییرات سیستم ایمنی و تغییر بیان mRNA ژنهای مرتبط با متابولیسم و پاسخ سیستم ایمنی در کبد دامها مشاهده گردید . - Vernay et al., 2012; Zarrin et al., 2015 - در مطالعه حاضر نتایج حاصل از تأثیر تزریق متابولیتها و همچنین تزریق LPS در کارتیههای پستانی بر بیان mRNA ژنهای انتخابی در مدت زمان 8 ساعت در جدول 1 نشان داده شده است. همانطور که دادهها نشان میدهند تزریق متابولیتها در 8 ساعت پایانی آزمایش سبب کاهش بیان mRNA ژنهای EFL5 و INSR در هر سه گروه تیمارهای تزریقی - P<0.05 - گردید.
تزریق LPS به داخل کارتیه پستانی بر روی بیان mRNA ژنهای ELF5, ACoAC, SREBF1, FASN اثر گذاشته و سبب کاهش بیان ژنهای مربوطه در کارتیه های پستانی LPS نسبت به کارتیه کنترل گردید . - P<0.05 - تزریق LPS سبب شد ژن GLUT1
