مقاله تکثیر هم دمایی به واسطه حلقه : روش تشخیص سریع و کم هزینه عوامل عفونی

بخشی از مقاله

تکثير هم دمايي به واسطه حلقه : روش تشخيص سريع و کم هزينه عوامل عفوني
چکيده
روش تکثير هم دمايي به واسطه حلقه (LAMP) مبتني بر تکثير اسيد نوکلئيک در دماي ثابت oC٦٥-٦٢ است . در اين روش بدون نياز به مرحله واسرشت شدن حرارتي، به کمک آنزيم DNA پلي مراز Bst به صورت هم زمان امکان جداسازي دو رشته DNA و تکثير وجود دارد. بنابراين بر خلاف ساير روش هاي متداول تکثيري، بدون نياز به چرخه هاي دمايي و دستگاه ترموسايکلر و با استفاده از تجهيزات ارزان قيمتي مانند حمام آب گرم و يا بلوک حرارتي قابل انجام است . براي طراحي واکنش LAMP نياز به ٦ عدد پرايمر وجود دارد که توانايي اتصال کاملا اختصاصي به ٨ ناحيه مجزا از توالي هدف را داشته باشند. در نتيجه واکنش LAMP مقدار بسيار زيادي محصول ايجاد ميشود که بدون نياز به روش پر زحمت الکتروفورز در ژل ، به کمک روش هاي ساده تري مانند مشاهده کدورت و يا تغيير رنگ ناشي از رنگ هاي فلورسنس در مخلوط واکنش به سادگي قابل تشخيص ميباشد.
بدين ترتيب روش LAMP با توجه به مزايايي مانند حساسيت و ويژگي مناسب ، کارايي بالا، عدم نياز به تجهيزات آزمايشگاهي گران قيمت و سادگي تشخيص ، ميتواند به عنوان ابزاري ارزشمند براي تشخيص سريع بيماريهاي عفوني در آزمايشگاه هاي کلينيکي و بيمارستاني به ويژه در کشورهاي درحال توسعه به کار برده شود. اين مقاله با هدف معرفي مباني و کاربردهاي روش LAMP در تشخيص عوامل عفوني تدوين گرديده است .
واژگان کليدي: LAMP، طراحي پرايمر، بهينه سازي

مقدمه
يکي از مهم ترين موفقيت هاي علمي بشر در قرن گذشته ، توانايي جداسازي و تشخيص ميکروارگا يسم هاي يماريزا، با استفاده از محيط کشت هاي مصنوعي و کشت سلولي بوده است که به دليل نياز به مراحل طولاني براي جداسازي و مشکلات مربوط به تفسير تايج ، به تدريج توسط روش هاي بيوشيميايي و سرولوژي جايگزين شدند. در حال حاضر، روش هاي سرولوژي متداول ترين ساده ترين راه تشخيص يماريهاي عفوني ميباشند. اما با وجود استفاده گسترده ، حساسيت بالايي ندارند و واکنش مثبت کاذب در آن ها بارها گزارش شده است . علاوه بر اين ، با توجه به اين که توليد آ تيبادي (Ab) ضد عامل عفونت زا در اغلب موارد چندين هفته به طول ميانجامد، نابراين تست هاي سرولوژي در مراحل اوليه بيماري مثبت نخواهند شد (١). يک سيستم ايده آل براي تشخيص يماريهاي عفوني بايد تواند طيف وسيعي از عوامل ميکروبي را در تمام مراحل يماري با سرعت ، حساسيت و ويژگي بالا تشخيص دهد و در اکثر مراکز تشخيصي به سادگي قابل انجام باشد. امروزه روش هاي مولکولي مانند ه بريدسازي در محل (in situ Hybridization) و روش هاي تکثير اسيد نوکلئيک براي تشخيص عوامل عفونت ز يز توسعه بسياري يد کرده ند. روش هاي تکثیر اسيد نوکل يک مانند PCR (٢ و 3)،nucleic acid sequence based amplification( NASBA ) (٤)، 3SR (self-sustained sequence replication) (٥) و SDA
(strand displacement amplification) (٦) با ارزش ترين روش ها در تمام زم نه هاي علمي از قبيل پزشکي کل نيکي و آزمايشات تشخيصي و ژن يکي ميباشند (٧). روش هاي NASBA و 3SR حساسيت بسيار بالايي دارند و قادرند کم تر از ١٠ نسخه در ميلي يتر اسيد نوکل يک هدف را در کم تر از يک ساعت تکثیر ک ند (٨). اما به د يل کم بودن ويژگيشان در انتخاب توالي هدف ، نيازمند ابزار دقيق براي تکثير و روش هاي يچيده براي تشخيص محصولات ميباشند. روش SDA با استفاده از ٤ پرايمر و شرايط هم دمايي، ويژگي يشتري دارد. اما به د يل هضم DNA غيرهدف و نياز به استفاده از نوکلئوتيدهاي تغيير يافته گران قيمت ، کاربرد تشخيصي ندارد (٩ و ١٠). در ين روش هاي تشخيصي مولکولي، انواع روش هاي مخ لف PCR مانند رونوشت برداري معکوس (RT-PCR)، آشيانه اي (nested-PCR)، چندگانه (Multiplex PCR) و زمان واقعي (real-time PCR) بيشترين موارد استفاده را دارند. حد تشخيص روش هاي PCR معمولي، کم تر از ٥٠ تا ١٠٠ نسخه در هر ميليل تر نمونه است (١١). براي افزايش حساسيت PCR معمولي، روش -nested PCR نيز توسعه پيدا کرده است . روش ياد شده به دليل استفاده از پرايمرهاي بيشتر، ويژگي بسيار بالايي براي تکثير ژن فراهم ميکند، اما به دليل انجام اين روش در دو مرحله ، احتمال آلودگي محصولات در هنگام ا تقال از مرحله اول PCR به مرحله دوم ، پاسخ مثبت کاذب را به دنبال دارد. از اين رو براي جلوگيري از ايجاد هر گونه آلودگي احتمالي نياز به پرسنل ماهر دارد. اخير نتايج مثبت کاذب ناشي از آلودگي در اين روش ، ين ٤ تا ٣١% گزارش شده است (١٢). روش real-time PCR از لحاظ کاهش احتمال آلودگي، سرعت ، ويژگي، اندازه گيري کمي و استاندارد سازي آسان ، نسبت به PCR معمولي برتري دارد. اما به د يل اين که براي تکثیر توالي هدف نيازمند کيت و تجهيزات گران يمت از قبيل نور سنج هايي براي ساطع کردن و جمع آوري نور، کامپيوتر و نرم افزار براي آنا يز داده ها است ، به عنوان يک ابزار تشخيصي متداول در آزمايشگاه هاي خصوصي و کلي يکي از آن استفاده نميشود (١١ و ١٣). به طور کلي، با وجود سرعت ، ويژگي و حساسيت بالاي روش هاي PCR، به د يل ياز به دستگاه گران قيمت ترموسايکلر براي تکثیر و الکتروفورز در ژل براي تشخيص محصولات ، در بسياري از مراکز تشخيصي قابل استفاده نخواهند بود. نابراين براي تکميل سيستم هاي مبني بر PCR توسعه روش هاي ساده ، ارزان و حساس تر ضروري به نظر ميرسد. در سال ٢٠٠٠ نوتومي (Notomi) همکاران و يک روش مبتني بر تشخيص اسيد نوکل يک ، به نام روش تکثير هم دمايي به واسطه حلقه ( Loop-mediated isothermal AMPlification) يا LAMP ر گزارش کردند. در اين روش اسيد نوکل يک هدف توسط آنزيم DNA ليمراز Bst و ٦ عدد پرايمر اختصاصي که ٨ ناحيه مجزا در توالي هدف را تشخيص ميدهند، تکثیر ميشود. آنزيم DNA پلي مراز Bst علاوه بر تک ير، قادر است دو رشته DNA را از يکديگر جدا کند. به عبارتي ديگر در اين روش ، DNA بدون ياز به چرخه هاي دمايي به صورت خود چرخه اي (self-cycling) تکثیر ميشود ( ١٤). نابراين روش LAMP ياز به دستگاه گران قيمت ترموسايکلر ندارد و به راحتي توسط حمام آب يا بلوک حرارتي منظم فراهم ک نده دماي يکنواخت (دماي بهينه براي فعا يت آنزيم DNA ليمراز Bst) انجام ميگيرد. در واقع مهم ترين مزيت روش LAMP از ديدگاه کشورهاي در حال توسعه با منابع مالي محدود، کم تر بودن هز نه ابزارهاي لازم براي تکثير است . ساختار ويژه پرايمرهاي LAMP و زياد بودن تعداد آن ها علاوه بر افزايش ويژگي واکنش ، نقاط آغازين ( priming) يشتري را براي DNA ليمراز فراهم ميکند و منجر به افزايش راندمان و سرعت تکثیر ميشود. به اين تر يب DNA هدف در مدت ٩٠-١٥ د يقه ١٠١٠–١٠٩ برابر ازدياد مييابد و مقدار بسيار زيادي محصول تو يد ميشود (١٦-١٤). به منظور تشخيص محصولات LAMP ميتوان همانند PCR از روش الکتروفورز در ژل استفاده کرد. اما به د يل تو يد مقدار زيادتري محصول واکنش LAMP نسبت به PCR، ميتوان با استفاده از رنگ هاي فلورسنس متصل شونده به DNA و يا از طريق ا باشته شدن محصولات جانبي، نتايج تکثیر را به تر يب به صورت تغيير رنگ يا ايجاد کدورت در ميکرو يوب حاوي محصولات به راحتي مشاهده کرد (١٧ و ١٨). نابراين براي بررسي نتايج واکنش LAMP نياز به روش پر زحمت الکتروفورز و استفاده از رنگ سرطان زاي ا يديوم برومايد وجود ندارد. علاوه بر اين ، با اندازه گيري تغيير در کدورت توسط کدورت سنج و رسم منحني استاندارد ميتوان ميزان محصولات و تعداد نسخه هاي ژن را به صورت کمي با روش real-time اندازه گيري کرد (١٩). يکي ديگر از مزاياي مهم واکنش LAMP اين است که کم تر از واکنش PCR تحت تا ير مهار ک نده هاي موجود در نمونه هاي کلي يکي قرار ميگيرد. نابراين برخلاف PCR لزوما نيازي به استخراج اسيد نوکلئيک هدف وجود ندارد و مستقيما بر روي نمونه هاي کلينيکي (با حساسيت کم تر) قابل انجام است (٢٢-٢٠). از ديگر ويژگيهاي مهم اين روش ، ادغام آن با روش رونوشت برداري معکوس (Reverse Transcription-LAMP)
است . بدين ترتيب ، در صورتي که اسيد نوکل يک هدف RNA باشد، با افزودن آنزيم رونوشت بردار معکوس (RT) به مخلوط واکنش ، RNA به عنوان الگو تکثیر شده و با حذف مرحله اضافي cDNA سازي باعث صرفه جويي در هزينه و زمان ميشود (٢٣ و ٢٤). روش LAMP تا کنون براي تشخيص انواع مختلفي از عفونت هاي ميکروبي توسعه يد کرده است . به طور کلي، روش LAMP با در نظر گرفتن مزايايي مانند سادگي، سرعت تکثير زياد و تشخيص آسان ، کاربردهاي بالقوه اي ر براي تشخيص کلي يکي و پايش بيماريهاي عفوني در کشورهاي در حال توسعه ميتواند داشته باشد. در اين مقاله مروري، چگونگي طراحي پرايمرها، روش انجام ، به نه سازي، حساسيت و ويژگي و کاربردهاي روش LAMP براي تشخيص عوامل عفوني مورد بحث قرار گر ته است .
طراحي پرايمرهاي LAMP
موفقيت واکنش LAMP در درجه اول بستگي به اختصاصيت پرايمرهاي طراحي شده دارد. به د يل اين که طراحي ٦ پرايمر ياز به ٨ توالي مجزا کاملا حفاظت شده در DNA هدف دارد، نابراين کاري بسيار يچيده و حساس ميباشد. اما در صورت طراحي دقيق پرايمرها، توالي هدف با ويژگي بسيار بالا تکثیر خواهد شد. ناحيه هدف براي طراحي پرايمرهاي LAMP ميتوان با کمک نرم افزار برخطprimer explorer (١٥) و يا با استفاده از نرم افزارهايي مانند 4MEGA به صورت دستي طراحي کرد واکنش LAMP در اصل توسط ٤ عدد پرايمر جام ميگيرد که به د يل داشتن ساختار ويژه قادرند ٦ ناحيه مجزا در توالي هدف را تشخيص دهند. اين پرايمرها شامل دو پرايمر داخلي به نام FIP و BIP ( Backward inner primer) و دو پرايمر خارجي به نام F3 (Forward) و B3 ميباشد. ساختارهاي ساقه - حلقه DNA، بخش هاي اصلي مراحل چرخه اي واکنش LAMP
ميباشند و نقش اصلي در تشکيل اين حلقه ها بر عهده پرايمرهاي داخلي است بدين تر يب هر کدام از آن ها بايد داراي دو ناحيه مجزا باشند. پرايمر FIP از سه بخش ، توالي مکمل رابط T-T-T-T و2F تشکيل شده است .
پرايمر BIP يز متشکل از توالي B1، رابط T-T-T-T و توالي مکمل ميباشد. رابط T-T-T-T به صورت يک لولا عمل کرده و در تشکيل حلقه و پديده خود-پرايمري (-self priming) دخالت دارد. پرايمرهاي F3 و B3 به تر يب خارج از نواحي F2 و B2 طراحي ميشوند و در مراحل او يه واکنش به آنزيم DNA ليمراز Bst در خارج سازي رشته کمک ميک ند (١٤، ١٥ و ٢٥). ناگامين (Nagamin) و همکاران در سال ٢٠٠٢ نشان دادند که با اضافه کردن دو پرايمر ديگر به نام پرايمرهاي حلقه (Loop)، توالي هدف سريع تر و با ويژگي بسيار بالاتري تکثير خواهد شد اين پرايمرها به حلقه هاي تک رشته اي موجود در ساختارهاي ساقه -حلقه ايجاد شده در مراحل مختلف واکنش LAMP تشکيل ميشوند متصل شده و با ايجاد مناطق آغازين يشتر براي DNA پليمراز، سرعت تکثیر توالي هدف را به طور قابل ملاحظه اي افزايش ميدهند. پرايمرهاي حلقه براي اتصال به نواحي ين F1 و F2 و B1 و B2 طراحي ميگردد و به تر يب Loop F و Loop B ناميده ميشوند (شکل ١). بنابراين بر اساس استفاده از پرايمرهاي حلقه دو نوع واکنش LAMP ميتواند وجود داشته باشد. در واکنش LAMP اصلي، نها از ٤ پرايمر و در LAMP سريع علاوه بر پرايمرهاي اصلي از پرايمرهاي حلقه يز استفاده ميشود. به عنوان مثال با توجه به شکل ٢ در واکنش LAMP اصلي نها دو عدد از حلقه ها (دو نقطه آغازين ) مورد هدف پرايمرها (FIP و BIP) قرار ميگيرد.

به عبارت ديگر، س تز از دو نقطه آغاز مي گردد. اما در واکنش LAMP سريع ، هر ٦ حلقه تک رشته اي توسط پرايمرهاي داخلي و پرايمرهاي حلقه مورد هدف قرار ميگيرند. از اين رو زمان مورد ياز براي واکنش LAMP سريع ، يک سوم تا يک دوم زمان مورد ياز براي واکنش LAMP عادي است (٢٦).

در طراحي پرايمرهاي LAMP چهار عامل اساسي، دماي ذوب يا Melting temperature( Tm)، درصد GC، پايداري انتهاي پرايمرها و ساختار ثانويه بايستي مورد توجه قرار گيرند.
حرارت Tm براي نواحي Fc1 و Bc1 بايد حدود C٦٥ (بين ٦٦-٦٤) و براي F2 B2، F3 وB3 حدود C٦٠ ( ين ٦١-٥٩) باشد. به عبارتي ديگر، براي اطمينان از ايجاد ساختارهاي ساقه - حلقه ، مقادير Tm براي Fc1 و Bc1 بايد کمي بالاتر از F2 و B2 باشد. علاوه بر اين ، براي اطم نان از اين که پرايمرهاي داخلي زودتر از پرايمرهاي خارجي به توالي هدف متصل شوند، مقادير Tm پرايمرهاي خارجي بايد کم تر از پرايمرهاي داخلي باشد.
محتواي GC پرايمرهاي LAMP بايد ين ٤٠ تا ٦٥ درصد باشد. به ويژه پرايمرهاي داخلي بايد طوري طراحي شوند که نتوانند به راحتي ساختار ثانويه تشکيل دهند. به همين دليل تو لي پايانه '٣ آن ها بايد غني از AT و يا مکمل پرايمرهاي ديگر باشد. طراحي پايانه '٣ پرايمرهاي B2.F2 B3.F3، LoopF.LoopB و پايانه '٥ پرايمرهاي Fc1.Bc1 بايد به شکلي باشد که انرژي آزاد (dG) آن ها کوچک تر يا مساوي با ٤- کيلو کالري بر مول باشد (٩). فاصله ين ا تهاي '٥ نواحي F2 و B2 (ناحيه اي که به وس له روش LAMP تکثیر ميشود) بايستي ين ١٨٠-١٢٠ جفت باز در نظر گر ته شود. همچ ين فاصله بين محل اتصال پرايمرها يز اهميت ويژه اي دارد. فاصله هاي بين F2 و F3 و همچ ين B2 و B3 بايد ين ٢٠-٠ جفت باز باشد.
از طرفي فاصله پايانه '٥ ناحيه F2 تا '٣ ناحيه F1 وهمچنين پايانه '٥ ناحيه B2 تا '٣ ناحيه B1 (ناحيه تشکيل حلقه ) بايستي ين ٦٠-٤٠ جفت باز در نظر گر ته شود. از طرف ديگر، غلظت پرايمرهاي داخلي بايد بيشتر از پرايمرهاي خارجي باشد. در مطالعات مختلف غلظت پرايمرهاي داخلي ٨ برابر پرايمرهاي خارجي و ٤ برابر پرايمرهاي حلقه (٤ : ٨ : ١) در نظر گر ته شده است (١٤ و ١٥).

ويژگيهاي آنزيم DNA ليمراز Bst
آنزيم DNA ليمراز Bst محصول ژن تغییر يا ته آنزيم DNA ليمراز باکتري باسيلوس استئاروترموفيلوس (فاقد دومين '٥ به '٣ اگزونوکلئازي) با وزن مولکولي ٦٧ کيلو د تون ميباشد.
اين آنزيم داراي فعا يت ليمرازي '٥ به '٣ و اگزونوکلئازي '٣ به '٥ است . همچ ين هم زمان با ليمريزاسيون ، توانايي جداسازي دو رشته DNA و س تز خود-چرخه اي DNA ر دارد (٢٧).
فعاليت به نه آنزيم در دماي ثابت 65C-60 به ويژه 63C است . اما با توجه به غيرفعال شدن آن در دماي بالاتر از 70C، از آن نميتوان به منظور PCR و تو لييابي با چرخه هاي دمايي استفاده کرد اما براي تکثیر هم دمايي DNA به ويژه تکثیر نواحي دشوار مانند تواليهاي تکرار شونده ، نواحي غني از GC و ساختارهاي ثانويه مناسب است (٢٨ و ٢٩).
مکانسيم واکنش LAMP
واکنش LAMP شامل دو مرحله غيرچرخه اي، تشکيل ساختار دو حلقه اي (دمبل شکل ) شروع کننده چرخه تک يري LAMP و مرحله چرخه اي، تکثیر توالي هدف ميباشد.
الف ) مرحله غيرچرخه اي: زماني که DNA دو رشته اي در دماي حدود 65oC-62 قرار ميگيرد يکي از پرايمرهاي داخلي (مثلا پرايمر FIP) واکنش ر آغاز ميکند بدين تر يب که ا تد قسمت F2 پرايمر FIP به توالي هدف متصل شده و از ا تهاي '٣ آن ، ساخت رشته مکمل توسط آنزيم DNA پليمراز Bst آغاز ميشود (ساختار ١) سپس پرايمر F3 به توالي هدف متصل
ميشود و آنزيم Bst، هم چنان که از ا تهاي '٣ پرايمر F3 س تز ر آغاز ميکند از طرف ديگر رشته تازه س تز شده متصل به FIP ر از رشته الگو جدا ميکند (ساختار ٢) در ن يجه رشته تازه س تز شده متصل به F3 و رشته الگو يک DNA دو رشته اي را تشکيل ميدهند (ساختار ٣) و رشته تازه س تز شده متصل به FIP به صورت تک رشته رها ميشود به د يل مکمل بودن نواحي F١ و Fc١ درپايانه '٥، يک حلقه تک رشته اي تشکيل ميشود (ساختار ٤). سپس اين ساختار ساقه -حلقه به عنوان الگويي براي آغاز سنتز توسط پرايمرهاي داخلي و خارجي بعدي عمل ميکند. با اتصال پرايمر BIP به ساختار ساقه -حلقه ، ساخت رشته مکمل از پايانه '٣ آغاز ميشود و با حرکت رو به جلوي آنزيم ، حلقه پايانه '٥ را باز ميکند. سپس پرايمر B3 به توالي هدف ميچسبد و مانند مرحله ياد شده با رشته لگو تشکيل يک DNA دو رشته اي را ميدهد (ساختار ٥). از طرف ديگر رشته مکمل متصل به BIP به صورت تک رشته اي جد ميشود. در نهايت به د يل وجود نواحي مکمل در پايانه هاي '٣ و '٥ ساختار دمبلي شکلي تشکيل ميشود (ساختار ٦) اين ساختار آغازک نده مرحله چرخه اي تکثیر LAMP ميباشد (شکل ٣- لف ).
ب ) مرحله چرخه اي: دراين مرحله پرايمرهاي خارجي دخالتي ندارند و تنها از پرايمرهاي داخلي و در صورت نياز از پرايمرهاي حلقه استفاده ميشود. پايانه آزاد '٣ در ساختار دمبل شکل (فلش نشان داده شده در ساختار ٦) به عنوان پرايمر عمل کرده و س تز DNA جديد را خود به خود آغاز ميکند (خود آغازگري يا Self-priming). بدين تر يب ساختار دمبل شکل بديل به ساختار ساقه -حلقه ميشود (ساختار ٧) . سپس با اتصال پرايمر FIP به حلقه تک رشته اي و گسترش رشته از پايانه '٣، رشته ساخته شده در مرحله خود-آغازگري از رشته الگو جدا ميشود. اما پايانه '٥ آن به ناحيه Fc1 پرايمر FIP ميچسبد و به صورت يک د باله متصل به DNA الگو باقي ميماند. در ن يجه ساختار ساقه -حلقه متشکل از يک ساقه -حلقه دو رشته اي يک ساقه -حلقه تک رشته اي تشکيل ميگردد.