بخشی از مقاله
استفاده از روش Nested- PCR براي شناسایی سروتیپ هاي ویروس برونشیت عفونی در گله هاي گوشتی داراي علائم تنفسی
چکیده:
بیماري برونشیت عفونی، یک بیماري ویروسی تنفسی حاد و بسیار واگیر ماکیان است که به دلیل کاهش رشد، کاهش بازده غذائی، ایجاد عفونت هاي توأم که منجر به تورم کیسه هاي هوائی و حذف لاشه هاي طیور در کشتارگاه ها می شود از اهمیت اقتصادي بالائی در طیور گوشتی برخوردار است. به منظور تعیین نقش سروتیپ هاي ویروس برونشیت عفونی در ایجاد عفونت تنفسی در گله هاي گوشتی در پاییز و زمستان 1390 از 9 گله جوجه گوشتی واقع در غزب مازندران که داراي علائم تنفسی بودند نمونه گیري از ناي، کلیه، سکال تونسیل به عمل آمد. ابتدا نمونه ها به تخم مرغ جنین دار 10 تا 11 روزه تلقیح شد ، سپس مایع آلانتوئیک تخم مرغ هاي تلقیح شده از نظر خاصیت هماگلوتیناسیون ( HA) براي ویروس هاي ND و AI ارزیابی شده و نمونه هاي مثبت با آنتی سرم اختصاصی نیوکاسل و آنفلوانزا مجاور شدند و از نظر وجود ویروس نیوکاسل یا آنفلوانزا به روش HI مورد بررسی قرار گرفتند. براي شناسائی ویروس برونشیت عفونی ابتدا RNA ویروس با استفاده از کیت تخلیص RNA از مایع آلاتنوئیک استخراج شد و در ادامه با استفاده از روش RT- PCR و با پرایمر هاي عمومی اقدام به شناسائی ویروس برونشیت عفونی نموده واز محصول RT-PCR با استفاده از پرایمر هاي اختصاصی به روش Nested PCR اقدام به شناسائی سروتیپ هاي ویروس برونشیت عفونی شد. از مجموع 9 نمونه اخذ شده از مزارع طیور گوشتی، 6 مورد از نظر ویروس هاي تنفسی مثبت بودند. از نظر برونشیت عفونی، در واکنش RT-PCR با پرایمر عمومی برونشیت عفونی 4 مورد مثبت شدند و در واکنش Nested PCR همه موارد از نظر سروتیپ 4/91 و mass مثبت شدند.
کلمات کلیدي: گله گوشتی، عفونت تنفسی، برونشیت عفونی، سروتیپ Nested-PCR ، مازندران
مقدمه
بیماري برونشیت عفونی یا (Infectious Bronchitis) IB یک بیماري ویروسی تنفسی حاد و بسیار واگیر ماکیان است که به دلیل کاهش رشد، کاهش بازده غذائی، ایجاد عفونت هاي همزمان که منجر به تورم کیسه هاي هوائی و حذف لاشه هاي طیور گوشتی در کشتارگاه ها می شود و نیز به دلیل افزایش تلفات، در پرورش طیور گوشتی از اهمیت اقتصادي بالائی برخوردار است6] و .[9 تلفات جوجه هاي گوشتی که عمدتا در دو هفته آخر پرورش و در سنین 5 تا 6 هفتگی به حداکثر می رسد اغلب در اثر عفونت هاي ثانویه باکتریائی اتفاق می افتد. این امر متعاقب آسیب هاي ایجاد شده به دستگاه تنفس در اثر ویروس برونشیت عفونی و سیستمیک شدن عفونت باکتریائی بروز می کند. بیماري برونشیت عفونی داراي انتشار جهانی است و ویروس عامل بیماري داراي سروتیپ هاي متعددي است. علاوه بر سروتیپ اصلی ویروس که سویه ماساچوست نام دارد و اولین بار در دهه 30 میلادي از آمریکا گزارش شد تاکنون سروتیپ هاي دیگري نیز از آمریکا، اروپا، آفریقاي شماي، آسیا و استرالیا شناسائی شده اند. وقوع بیماري برونشیت عفونی در گله هاي واکسینه شده نیز به فراوانی اتفاق می افتد. در چنین مواردي ممکن است سویه هاي ویروس جدا شده با سویه واکسن متفاوت باشند. ویروس IB داراي سویه هاي مختلفی است. این سویه ها شامل سویه ماسوچوست (Mass) که متداولترین سویه است و داراي انتشار جهانی است و سروتیپ هاي کانکتیکت، ارکانسا و DE/072 از آمریکا، سروتیپ T از استرالیا، سروتیپ هاي D1466 ، 793B(4/91) ، B1648 از اروپا و سایر سویه ها مانند Holt ، Gray می باشد6] و 8 و .[9 در سال هاي اخیر که بروز کمپلکس تنفسی در گله هاي طیور خسارت اقتصادي سنگینی وارد نموده است، شناسائی نقش ویروس هاي تنفسی در بروز عفونت هاي تنفسی اهمیت بیشتري یافته است. یکی از ویروس هاي مهم تنفسی طیور ویروس برونشیت عفونی است که با توجه به تنوع سروتیپ هاي آن و با در نظر گرفتن این واقعیت که بین سروتیپ ویروس واکنش هاي ایمنی متقاطع وجود ندارد، شناسائی و جداسازي سروتیپ هاي ویروس برونشیت عفونی در گله هاي میتلا به کمپلکس تنفسی، در اجراي برنامه هاي پیشگیري، انتخاب نوع و سویه واکسن و نهایتا پیشگیري از بیماري می تواند مفید باشد.
تئوري و پیشینه تحقیق:
Roussan و همکاران عفونت همزمان دستگاه تنفسی را در جوجه هاي گوشتی مبتلا به علائم تنفسی مورد بررسی قرار دادند. از مجموع گله هاي الوده 13 درصد به ND و 11 درصد به IB آلوده بودند و آلودگی همزمان ویروسی به شرح زیر مشاهده شد. 9/6 درصد آلودگی همزمان ND و IB ، 21 درصد آلودگی همزمان ND و AI ، 15/7 درصد آلودگی همزمان IB و AI ، و 2/6 درصد همزمان به سه ویروس ND، IB و AP (پنوموویروس ها ) آلوده بودند. بقیه موارد آلودگی همزمان ویروسی و مایکوپلاسمائی بوده است(.(11
(2010) Toroghi به منظور مطالعه عفونت همزمان تنفسی ویروس هاي آنفلوانزا، نیوکاسل و برونشیت عفونی ،40 نمونه ناي از جوجه هاي مبتلا به کمپلکس تنفسی را به روش جداسازي ویروس و RT-PCR مورد مطالعه قرار داد. موارد ابتلا به ویروس هاي H9N2 ، IB(4/91) ، IB(Ma) و ND به ترتیب 85 درصد، 67/5 درصد، 13 درصد و 2 درصد بوده است. همچنین موارد آلودگی همزمان به H9N2 و برونشیت عفونی 67/5 درصد و آلودگی همزمان به ND و برونشیت عفونی 2/5 درصد بوده است(.(13
صیفی آباد شاپوري و همکاران در سال 1381 با انجام آزمایش RT-PCR اقدام به جداسازي و شناسائی ویروس برونشیت عفونی طیور در ایران و تعیین تیپ برونشیت عفونی با آزمایش RT-PCR نمودند. در این مطالعه به منظور شناسائی سویه هاي ویروس برونشیت عفونی از موارد مشکوك به ابتلا به این ویروس نمونه هاي ناي و ریه اخذ و مورد آزمایش قرار گرفتند و پس از آماده سازي به داخل حفره آلانتوئیک تخم مرغ هاي جنین دار 9 روزه تلقیح شدند. پس از انجام مراحل جداسازي و شناسائی، سروتیپ جدایه ها با آزمایش RT-PCR و با استفاده از پرایمرهاي ویژه مورد بررسی قرار گرفتند. در این تحقیق از مجموع 181 نمونه مورد آزمایش از 27 نمونه ویروس برونشیت عفونی جدا شد و بر اساس نتایج RT-PCR بر روي 14 جدایه ، 12 جدایه متعلق به سویه Mass و 2 جدایه متعلق به سویه 793/B بوده است.[12]
سیفی و همکاران وقوع آنفلوانزا و برونشیت عفونی را در گله هاي طیور گوشتی استان فارس که داراي علائم تنفسی بودند مورد مطالعه قرار دادند. در این تحقیق ویروس برونشیت عفونی در 12 گله از مجموع 30 گله (%40) و ویروس آنفلوانزاي پرندگان در 16 گله (%53.3) رد یابی شد. در این بررسی از نظر سروتیپ هاي مختلف ویروس برونشیت عفونی ، نمونه هاي ناي 11 گله از نظر سروتیپ 4/91 مثبت بودند و یک کله نیز از نظر سروتیپ Mass مثبت بود. 4 گله داراي عفونت توام با سروتیپ 4/91 برونشیت و تحت تیپ H9N2 بودند(.(1
در مطالعه غلامی و همکاران که براي ردیابی ویروس هاي آنفلوانزا و برونشیت عفونی در گله هاي طیور گوشتی داراي علائم تنفسی در استان اصفهان انجام شد، از مجموع 30 گله مورد بررسی 16 گله (53.3%) از نظر ویروس آنفلوانزا، 12 گله (%40) از نظر ویروس برونشیت عفونی و 4 گله نیز از نظر آلودگی توام آنفلوانزا و برونشیت عفونی مثبت بودند(.(2
مواد و روش کار:
در این تحقیق از مرغداري هاي صنعتی واقع در غرب مازندران که داراي علائم تنفسی بودند، نمونه گیري به عمل آمد. نمونه ها از بافت هایی مانند ناي، ریه ها و کیسه هاي هوائی، سکال تونسیل انتخاب شدند و براي بررسی ویروس شناسی به موسسه رازي ارسال شدند. از نمونه ها، ابتدا یک سوسپانسیون %10 در محلول سالین بافر فسفاته با PH خنثی تهیه شد. سپس براي جلوگیري از آلودگی ثانویه به آن آنتی بیوتیک اضافه شد .
براي تلقیح نمونه ها در داخل حفره آلانتوئیک، چهار عدد تخم مرغ جنین دار براي هر نمونه انتخاب شده و و با استفاده از سرنگ توبرکولین و سر سوزن 25 میزان 200 میکرو لیتر از مایع تلقیح را به تخم مرغ جنین دار 10 تا 11 روزه تلقیح نموده و تخم مرغ ها را انکوبه نمودیم. تلفات جنینی طی 24 ساعت اول پس از انکوباسیون حذف شده و تخم مرغ هائی که جنین هایشان 48 ساعت پس از تلقیح تلف شدند به یخچال منتقل شده، جهت برداشت مایع آلانتوئیک مورد استفاده قرار گرفتند. در ادامه مایع آلانتوئیک برداشت شده از نظر ویروس برونشیت عفونی با روش RT-PCR و براي شناسائی سروتیپ هاي ویروس برونشیت عفونی به روش Nested PCR مورد آزمایش قرار گرفت. همچنین مایع آلانتوئیک برداشت شده از نظر خاصیت هماگلوتیناسیون ( HA) براي ویروس هاي ND و AI مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه هاي مثبت HA با آنتی سرم اختصاصی نیوکاسل و آنفلوانزا مجاور شده و از نظر وجود ویروس نیوکاسل و آنفلوانزا به روش HI مورد ارزیابی قرار گرفتند.
تخلیص RNA و انجام RT-PCR و Nested PCR براي شناسائی ویروس برونشیت عفونی
RNA ویروس با استفاده از کیت تخلیص (High Pure Viral Nucleic Acid Kit) RNA ساخت شرکت Roche استخراج شد و در 50 میکرولیتر آب دو بار تقطیر استریل حل شد. واکنش RT-PCR طی مراحل مختلف انجام گرفت که شامل:-1 مرحله نسخه برداري معکوس از RNA و سنتز cDNA است در دماي 45 درجه به مدت 45 دقیقه -2 واسرشت سازي اولیه ( primary Denaturation) cDNA در دماي 94 درجه به مدت 2 دقیقه، -3 واسرشت سازي ثانویه در دماي 94 درجه به مدت 1 دقیقه، -4 اتصال پرایمرها (Annealing) یا هم سرشت سازي در دماي 48 درجه به مدت 1 دقیقه، -5 گسترش اولیه در دماي 68 درجه به مدت 1 دقیقه و -6 گسترش ثانویه در دماي 68 درجه به مدت 10 دقیقه می باشد. لازم به یادآوري است که مراحل 3 تا 5 یعنی واسرشت سازي ثانویه، هم سرشت
