مقاله تشخیص سایتومگالو ویروس با روش تکثیر هم دما به واسطه حلقه ( LAMP )

بخشی از مقاله

چکیده

پیش زمینه و هدف: سیتومگالوویروس انسانی یکی از اعضای خانواده هرپس ویروس هاست و به دنبال آن یکی از شایع ترین عوامل ایجاد کننده ناهنجاری های مادرزادی مانند کری و عقب ماندگی ذهنی است. این ویروس از عوامل ایجاد عفونت مادرزادی در نوزادان است. وقوع عفونت مادرزادی سیتومگالوویروس در موالید زنده توسط سیتومگالوویروس 0/2 تا 2/2 درصد برآورد شده است. عفونت مربوط به این ویروس در بیماران ضعف ایمنی مانند بیماران مبتلا به ایدز و بیماران دریافت کننده پیوند عضو، باعث ایجاد ناهنجاری موارد منتهی به مرگ می شود. تکنیک مولکولی تکثیر هم دما به واسطه حلقه - LAMP - روش تکثیری جدید جهت تشخیص می باشد. در این مطالعه به بررسی روش LAMP در تشخیص بیماری مربوط به CMV پرداختیم.

روش: در این مطالعه از یک دسته 6 تایی پرایمر اختصاصی ژن های 7US و 8US جهت شناسایی ویروس استفاده شد. تست LAMP اپتیمایز و حد تشخیص - Limit of - Detection و اختصاصیت بررسی گردید. این
مطالعه بر روی تعداد 100 نمونه سرم    مثبت که از آزمایشگاه نور تهیه شده بود انجام شد.

نتایج: تست LAMP اپتیمایز شده ، با اضافه کردن رنگ سایبر گرین به لوله حاوی واکنش LAMP،با تغییر رنگ به سبز، مشخص شد. همچنین محصول تکثیر شده بر روی ژل جهت تایید، الکتروفورز شد. میزان حد تشخیص این تکنیک 10 پارتیکل ویروس تعیین گردید. انجام تست اختصاصیت نیز با استفاده از روش onlineو DNA شش ارگانیسم دیگر ویژگی 100 درصد نشان داد. DNA نمونه ها به روشDNG استخراج گردید و توسط واکنش LAMP تست گردید. از بین 100 مورد افراد IgG CMV مثبت، 5 نمونه با روش اپتیمایز شدهLAMP ، مثبت شدند.

بحث: این تکنیک نسبت به دیگر تکنیک های مولکولی، ارزان تر، سریعتر و اختصاصی تر است و از این تکنیکمی توان با اطمینان بالایی در همه سطوح بالینی و حتی مناطق محروم و روستایی جهت تشخیص CMVDNA استفاده کرد

مقدمه

سایتومگالو و ویروس انسانی - HCMV - نام بومی هرپس ویروس انسانی 5 است که یک ویروس از خانواده هرپس ویریده می باشد. سایتومگالو ویروسها، هرپس ویروسهایی هستند که در همه جا پراکنده بوده و از عوامل شایع بیماری انسانی هستند.

این ویروس از مهم ترین علت عفونت های داخل رحمی است که %.2تا 2درصد از نوزادان متولد شده را تحت تأثیر قرار میدهد. احتمال آلوده شدن جنین و علامت دار بودن آن در زمان تولد و احتمال بروز عوارض شنوایی و شناختی در عفونت اولیه مادر بیشتر از زمانی است که فعالیت مجدد و یا عفونت با سروتیپ جدید ویروس صورت گرفته باشد.

درصد زنان باردار به عفونت اولیه مبتلا می شوند که از اینها 30-40 درصد جنین شان دچار عفونت می شود. که 10-15 درصد این تولدها دارای عفونت علامت دار خواهند بود و 85-90درصد بدون علامت خواهند بود. از 10-15 درصد جنین دارای عفونت علامت دار، 20-30 درصد در اثر عفونت شدید می میرند و 80درصد عفونت علامتدار خواهند داشت با علائم شدید و موربیدیته شدید نورولوژی. در بچه های بدون علامت 10-15درصد همراه با یک سری علائم و آبنرمالیته هستند که در 2سال اول زندگی خود را نشان خواهند داد. بخصوص ناشنوایی در 40درصد ناشنوایی 2جانبه است بنابراین یک برنامه ریزی غربالگری که از این آسیب شنوایی جلوگیری کند ضروری ست

شیوع عفونت سیتومگالو ویروس در ایران مشابه دیگر کشورهای در حال توسعه و کمی بالاتر از کشورهای توسعه یافته است. - 6 - علت شیوع بالای سیتومگالوویروس در ایران و دیگر کشورهای در حال توسعه نسبت به کشورهای توسعه یافته را میتوان به پایین بودن سطح بهداشت در این کشورها، تعداد بیشتر افراد خانواده و تمامی زیاد آنها با هم و تغذیه از طریق شیر مادر ربط داد.

در میزبان هایی با ضعف ایمنی عفونت های اولیه و راجعه سیتومگالوویروس، میزان بروز معلولیت - موربیدتی - و موارد منتهی به مرگ - مورتالیتی - افزایش می یابد. و در بیماران مبتلا به ایدز، عفونت سیتومگالوویروس تمایل زیادی به انتشار درد و کوریورتینیت در این بیماران موجب کوری پیشرونده می شود. همچنین دریافت کنندگان پیوند در معرض خطر بالایی برای ابتلا به این عفونت هستند.

تشخیص زود هنگام عفونت به وسیله روش های حساس می تواند برای جستجو و درمان دریافت کنندگان در معرض خطر بالای توسعه بیماری مفید باشد - . - 7 تشخیص پیش از تولد نقش اساسی در مدیریت بارداری همراه با این ویروس دارد - - 8 ترکیبی از تست ها و روش ها جهت تشخیص CMV شامل سرولوژی، روش کشت تست shellvial یا DEAFF، روش های آنتی ژنومی و روش های تشخیص DNA مربوط به CMV مثل هیبریدیزاسیون DNA، روش های تکثیر اسید نوکلئیک مثل PCR، NASBA، 3SR، و روش LAMP وجود دارد.

اساسی ترین روش سنتی شامل رشد ویروس CMV در کشت سلولی است. چنین کشت هایی که بر اساس کشت آهسته هستند، تکنیک های با استاندارد طلایی جهت تشخیص دقیق و مناسب نیستند. - 9 - روش آنتی ژنومی روش حساس و همچنین یک روش تشخیص کمی است اما این روش اختصاصیت پایینی دارد. - 7 - تست های سرولوژیک به علت بالا یا پایین شدن میزان آنتی بادی ها، ارزش تشخیصی کمی در تشخیص عفونت CMV در بیماران پیوند عضو دارند.

در بیماران با ضعف ایمنی ممکن است با وجود فعال بودن ویروس، سطح پایین تر از حد انتظار در تیتر آنتی بادی های IgGو IgMوجود داشته باشد .روش هیبریدیزاسیون اسید نوکلئیک که جهت تشخیص CMV یک روش قوی نیست که کاربرد آن را محدود کرده به طوری که بیشتر در تحقیقات کاربرد دارد. بسیاری از دانشمندان معتقدند که ابداع تکنیک های مولکولی تکثیری نقطه عطف چهارم در بیولوژی می باشد اولین و شاید بتوان گفت مهمترین سیستمی که در آن ملکول هدف افزایش تعداد می یابد تکنیک PCRمی باشد.

یکی از معایب روش PCRمسأله آلودگی است. به علت حساسیت بالا و قدرت تکثیر زیاد هر قطعه DNAخارجی که وارد محیط PCRمی شود، مورد تکثیر قرار گرفته و نتایج عجیب و دور از واقعیتی ممکن است ایجاد کند - 13 - یکی از مهم ترین معایب PCRپر هزینه بودن آن است

سیستم تکثیر براساس نسخه برداری یا NASBAیا TASکه از محدودیت های این سیستم نیاز به مرحله دناتوراسیون حرارتیRNA-DNAدر طی هر سیکل است که نتیجه آن از بین رفتن آنزیم ها و نیاز به تجدید آنها بعد از حرارت است روش تغییر یافته TASرا همانند سازی خودنگهدارنده یا 3SR نامیده اند که این تکنیک علی رغم قدرت زیاد، کاربردش در چند ساله اخیر زیاد نیست . 

تکنیک ازدیاد تکثیر رشته جابجا شونده - SDA - که در آن ملکول هدف دناتوره و سپس پرایمرها به ترادف های مکمل خود در هدف می چسبند. یکی از محدودیت های این روش، محدودیت اندازه هدفی است که تکثیر آن مورد نظر است و دیگر محدودیت آن نیاز به آنزیم های محدود کننده جهت هضم DNA ژنومیک در محل هدف قبل از فرآیند تکثیر است.

تکنیک تکثیر هم دما با واسطه حلقه یا LAMP روشی است که اولین بار توسط Notomi در سال 2000 جهت تشخیص ویروس هپاتیت B شرح داده شد. میتوانتدر کمتر از یک ساعت تحت شرایط هم دما DNA هدف را تا 109کپی تکثیر کند

این واکنش به یک DNA پلیمراز با خاصیت جابجاسازی رشته سنتز شده و 6 دسته پرایمر طراحی شده که به 8 ناحیه مجزا از ژن هدف را شناسایی می کنند. نیاز دارد. - - 14 - شکل - 1 از مزایای این تکنیک این است که میتواند سکونس خاص از DNA را تحت شرایط هم دما تکثیر کند این تکنیک می تواند با فعالیت ترانس کریپتاز معکوس سکونس RNAهدف را نیز با کارایی بالایی تکثیر کند و مهم تر اینکه این روش نیاز به دناتوراسیون DNAهدف ندارد و نهایتاً DNA تک رشته از محصولات LAMP قابل جداسازی است.

شکل :1 طراحی 6 پرایمر واکنش LAMP براساس 8 ناحیه مجزا در ژن هدف