بخشی از مقاله
چکیده :
در این مقاله روش ﲠینه شده ایی جهت ﲥیه تایروزیناز در مقیاس صنعتی از قارچ خوراکی با خلوص نسبی %75 معرفی شده است. این روش 5 مرحله ایی شامل خرد کردن قارچ منجمد ﲠمراه شستشو با -2پروپانل, استخراج بکمک بافر تریس بازی, رسوبدهی دو مرحله ایی بکمک آمونیوم سولفات, دیالیز و لیوفیلایز است. بازده جرمی این روش در حدود %0/07 با فعالیت کروزولیزی و کاتاکولیزی ویژه بﱰتیب - 1/46 - و - 4/5 - مایکرومول در دقیقه می باشد. مطالعات پایداری آنزﱘ موید پایداری نسبی بالاتر - %20 - آن نسبت به ﳕونه ﲡاری شرکت سیگما میباشد. برای تکمیل شرایط فورمولاسیون, اطلاعات مربوط به ناخالصیهای پروتئینی نیز از روی الگوهای الکﱰوفورتیکی, وزن ملکولی و نقاط ایزوالکﱰیک در دست ﲥیه میباشد.
کلمات کلیدي : تایروزیناز, قارچ خوراکی, پروتئﲔ هاي سیتوپلاﲰی
مقدمه :
یکی از وظایف بیوتکنولوژي معرﰲ آنزﱘ هایی است که بتوانند جایگزین معرفات و کاتالیزورهاي شیمیائی در صنایع ﳐتلف گردند. مطالعه آنزﱘ هاي ﳐتلف از منابع متفاوت و یا تولید آنزﱘ ها بکمک روشهاي متنوع مهندسی ژنتیک از ﲨله تلاشهاي باارزش پژوهشگران در این زمینه می باشد. با اینحال استفاده آنزﱘ ها در صنعت می بایست مقرون به صرفه باشد. مقدار آنزﱘ, فعالیت, پایداري و مراحل ﲥیه از ﲨله مهمﱰین پارامﱰهایی هستند که اقتصادي بودن بکارگﲑي آنزﱘ ها را در صنعت تعیﲔ می کند.ﲢقیقات چند دهه قبل بر روي تایروزیناز نشان داده که میتوان از این آنزﱘ براي زیست-تبدیلات - Biotransformation - ترکیبات فنلی به مشتقات کاتکوﱄ مانند ال-دوپا استفاده ﳕود. بکمک فعالیت کاتاکولیز این آنزﱘ ﳘچنﲔ میتوان ترکیبات فنلی را به ترکیبات کوئینونی که هنایتا پلیمرهاي قابل ﲡزیه در طبیعت میشوند تبدیل کرد.
بنابراین از تایروزیناز می توان براي حذف آلودگیهاي فنلی از منابع ﳐتلف طبیعت مانند خاک , آب - Bio-remdiation - کمک گرفت . - 1 - گرچه تایروزینازهاي استخراج شده از منابع ﳐتلف پایداري بالائی از خود نشان نداده اند, اما بطور نسﱯ پایداري تایروزیناز قارچ خوراکی ﲠﱰ بوده و مهمﱰ اینکه مقدار این آنزﱘ بطور طبیعی در انواع قارچ خوراکی بالاست. ﳘﲔ مشخصات سبب شده که تایروزیناز قارچ خوراکی توسط دانشمندان متعددي مورد مطالعه قرار گﲑد . - 2 - در حال حاضر نیز تایروزیناز ﲡاري از قارچ خوراکی ﲥیه میشود. مطالعات باارزشی بر روي ساختمان, مهار, پایداري و ﲥیه این آنزﱘ توسط این تیم تا ﲝال صورت گرفته است 4 - و. - 3اما با توجه باینکه منبع ﲥیه آنزﱘ کاملا غﲑ ﲰی است و ساده سازيفرآیند ﲥیه آنزﱘ میتواند نقش مهمی در اقتصادي ﳕودن آن داشته باشد,در این مقاله روش نویﲏ براي ﲥیه تایروزیناز از قارچ خوراکی در مقیاس بزرگ معرﰲ میگردد.
مواد و روشها
قارچ خوراآی - Agaricus bisporous - از بازار ﲥران ﲥیه و در دمای -20 درجه سانتیگراد منجمد و نگهداری شد. کلیه مواد شیمیایی بکار گرفته شده دراین ﲢقیق از ﳕونه های معتﱪ ﲡاری برداشته شدند. اندازه گﲑیهای اسپکﱰوفتومﱰی توسط دستگاه - ANALYTIKJENA - SPECORD-210 صورت گرفت. تغلیظ ﳕونه های پروتئینی بکمک دیافیلﱰاسیون - AMICON MILLI PORE - و لیفیلایز آهنا توسط دستگاه - ZIRBUS - SUBLIMATOR_5 ﳎهز به پمپ - VACUUBRAND- 6 - اﳒام شد.
استخراج پروتئﲔ
120 گرم قارچ منجمد را بکمک جویسر1خرد و با -2پروپانل آاملا" شستشو داده شد. سپس با استفاده از یک آیسه پارچه اي -2پروپانل را جدا و ﲬﲑ ﲜامانده سه بار با 120 میلی لیﱰ بافر تریس بازي با غلظت 10 میلی مولار حاوی 1 - میلی مولار - آنﱵ پروتئاز - - PMSF مورد استخراج قرار گرفت. پس ازحذف مواد غﲑ ﳏلول از سوپرناتانتها بکمک سانﱰیفیوژ سیگماي ﳜچالدار - به مدت 20 دقیقه در دماي 4 درجه سانتیگراد و با 8000 دور در دقیقه - حجم آهنا بوسیله دیا فیلﱰاسیون کاهش داده شد. ﳏلول بدست آمده در دومرحله پی در پی %35 و %75 اشباع نسبت به آمونیوم سولفات رسوبگﲑی شد. رسوﲠای هر مرحله بکمک سانﱰیفیوژ سیگماي ﳜچالدار ﲨع آوری شد.رسوب مرحله دوم در 15 میلی لیﱰ بافر فسفات حل وﲟدت یک ساعت ونیم در دماي 4 درجه سانتیگراد دیالیز گردید. این ﳕونه ابتدا ﲟدت 12 ساعت در -20 درجه سانتیگراد و سپس ﲟدت 12 ساعت در - 70 درجه سانتیگراد نگهداري و هنایتا با استفاده از دستگاه فریزدرایر کاملا" خشک گردید.
عیار سنجی فعالیت آنزﳝی
هر دو فعالیت کرزولیز و کاتاکولیز تایروزیناز طبق روش معرفی شده - 1 - مورد بررسی قرار گرفت. بنابراین فعالیت کاتاکولیز تایروزیناز استخراج شده در مقابل سوبسﱰاي کافئیک اسید - ضریب خاموشی- - 12000M1- Cm1 با غلظت 50 میلی مولار به روش اسپکﱰوفتو مﱰي در طول موج 311 نانومﱰ در مدت 5 دقیقه اندازه گﲑي شدکه کاهش چگاﱄ نوري در 311 نانومﱰ در5 دقیقه مؤید میزان فعالیت نسﱯ آنزﱘ است. فعالیت کروزلیز تایروزیناز نیز در مقابل سوبسﱰاي متیل فنل - ضریب خاموشی- - 20800 M1-Cm1 با غلظت 5/5 میلی مولار به روش اسپکﱰوفتو مﱰي در طول موج 352 نانومﱰ در مدت زمان 20 دقیقه اندازه گﲑي شد.
ﲥیه پروفایل پروتئﲔ هاي سیتوپلاﲰی
اطلاعات مربوط به پروتئﲔ هاي سیتوپلاﲰی قارچ خوراکی - Agaricus bisporus - از پایگاه هاي اینﱰنﱵ - http://www.expasy.org/toolو - www.rcsb.org/pdb ﲨع آوری گردید. رسوب دهی مرحله ایی و ﲥیه الگوهای الکﱰوفورتیکی ﲢت شرایط - native PAGE - از ﲨله تکنیک های بکار گرفته شده در این مطالعات میباشند.
نتایج و ﲝث
مزایای روش ﲥیه آنزﱘبا توجه باینکه کاهش مراحل ﲥیه یک آنزﱘ به اقتصادی بودن روش ﲥیه کمک شایانی میکند, در این ﲢقیق سعی شده تا مراحل غﲑضروری حذف گردند.
ﳘچنﲔ تکنیک های بکار گرفته شده جهت استخراج و ﲣلیص نسبی آنزﱘ رابراحتی می توان در مقیاس بزرگ بکاربست.. شکل - 1 - مراحل ﲥیه تایروزیناز از قارچ خوراکی را که در این ﲢقیق مورد مطالعه قرارگرفته نشان میدهد.بکارگﲑی حلال -2پروپانل در ﲥیه تایروزیناز از قارچ خوراکی برای اولﲔ بار در این مقاله معرفی میشود. مطالعات اﳒام شده در این طرح نشان دا د که جهت حذف ترآیبات فنلی - که حﲔ خرد کردن قارچ آزاد شده و میتوانند با تایروزیناز واکنش داده و ملانﲔ تولید کنند - میتوان از - 2 پروپانل استفاده کرد. بکارگﲑی حلاﳍای آلی حﲔ استخراج آنزﱘ های متفاوت از منابع طبیعی تکنیک شناخته شده ایی است. برخی از ﳏققﲔ برای حذف مزاﲪت ترکیبات فنلی در حﲔ استخراج تایروزیناز از اسﱳ استفاده کرده اند - . - 5
نکته مهم در بکارگﲑی یک حلال آلی در فرآیند ﲥیه یک آنزﱘ, تاثﲑ حلال آلی بر ساختمان پروتئینی آن میباشد. نتایج سنتیکی بدست آمده در این ﲢقیق موید این واقعیت است که 2 -پروپانل با توانائی حذف ترکیبات فنلی به ساختمان های سوم و چهارم تایروزیناز آسیب غﲑقابل بازگشت وارد ﳕیکند.نکته قابل ذکر دیگر در مورد بکارگﲑی -2پروپانل در حﲔ استخراج تایروزیناز, قابلیت این حلال برای جذب برخی از پروتئﲔ های هیدروفوب سیتوپلاﲰی است. نتایج آزمایشات نشان میدهد که قریب %17 پروتئﲔ های سیتوپلاﲰی توسط -2پروپانل جذب میشوند. بکمک این روش تایروزیناز با بازده جرمی %0 /07 با فعالیت کروزولیزی و کاتاکولیزی ویژه بﱰتیب - 1/46 - و - 4/5 - مایکرومول در دقیقه حاصل گشت. مطالعات پایداری آنزﱘ موید پایداری نسبی بالاتر آن نسبت به ﳕونه ﲡاری شرکت سیگما میباشد.
پروتئﲔ های سیتوپلاﲰی
بر طبق اطلاعات ﲨع آوری شده از بانک های اطلاعات پروتئینی اکثرپروتئﲔ هاي سیتوپلاﲰی قارچ، آنزﱘ بوده و در گروه اکسیدوردوکتاز قراردارند مثل پلی فنل اکسیداز و تایروزیناز. نقطه ایزوالکﱰیک اکثر
