مقاله تنوع ژنتیکی در کلونهای زراعی و گونه های وحشی زعفران ایران

بخشی از مقاله

چکیده:

با توجه به اهمیت اقتصادي زعفران و همچنین تنوع ژنتیکی گسترده جنس Crocus در ایران، تحقیق حاضر با هدف تعیین ساختار تنوع ژنتیکی در کلونهای زراعی و وحشی زعفران انجام گردید. بدین منظور 19 ژنوتیپ وحشی جمع آوري شده از مناطق مختلف آشور و 6 آلون زراعی مورد آشت در استانهاي خراسان, گلستان و فارس با استفاده از10 نشانگرمولکولی SRAP بررسی گردید. در تجزیه خوشه اي 4 آلاستر بزرگ ایجاد شد و ژنوتیپ هاي زراعی در یک آلاستر و نمونه هاي ژنتیکی مربوط به هر گونه وحشی نیز در گروه ها و آلاسترهاي متمایز طبقه بندي شدند. یکی از مهمترین نتایج تنوع در نمونه هاي زراعی بود بطوریکه نمونه هاي خراسان در یک آلاستر و نمونه هاي گلستان و استهبان در آلاستر دیگر قرار گرفتند. مقدارPIC بالا براي جفت آغازگر EM1-ME5 نشان دهنده کارایی بالای آنها درتمایز ژنوتیپ هاي مورد استفاده در این تحقیق بود. تجزیه به محورهاي اصلی نتایج حاصل از تجزیه خوشه ای را تایید نمود. این موضوع نشان داد آه اولآ تنوع قابل ملاحظه اي در تنوع جنس زعفران در ایران وجود دارد. ثانیاً تکنیک SRAP توانست گونه هاي مختلف را از هم متمایز سازد.

کلمات کلیدي: زعفران، تنوع ژنتیکی، SRAP ، Crocus

مقدمه:

علارغم مطلعات سیتولوژي، مورفولوژي و آاریوتایپی مختلف، گونه اجدادي و مکانیزمی آه باعث به وجود آمدن زعفران زراعی می شود ناشناخته است. براي ساختن یک مجموعه مفید براي اصلاحگران ویژگیهاي مورفولوژیکی و مولکولی زعفران مورد نیاز است. اما مارآرهاي مولکولی آه براي بهبود ژنتیکی این جنس قابل آاربرد است، محدودمی باشد. تنها مارآرهاي رپید2 - 1 و - 4 و ا.اف.ال.پی - 6 - 2 براي بررسی منشأ زعفران زراعی وطبقه بندي و تعین رابطه آن با گونه هاي اجدادي استفاه شده اند. گام اول در انجام هر گونه برنامه اصلاحی و به نژادی فراهم نمودن ژرم پلاسم مناسب و ایجاد تنوع ژنتیکی می باشد و با توجه به عقیمی و تریپلوئید بودن گونه زراعی زعفران و تکثیر غیر جنسی آن بنظر می رسد تنوع ژنتیکی ارقام زراعی و تجاری آن بسیار پائین باشد. در حالیکه بواسطه تنوع گسترده جنس زعفران در ایران انتظار می رود تنوع ژنتیکی گونه های خویشاوند وحشی آن در ایران بسیار بالا باشد. بنابراین تحقیق حاضربا بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین الگوی تنوع ژنتیکی گونه های زعفران جمع آوری شده از سراسرایران بااستفاده از مارآراس.رپ3 انجام شد.

مواد وروشها:

نمونه های گیاهی مورد استفاده از مناطق مختلف ایران از طریق بانک ژن گیاهی ملی ایران در مرکز تحقیقات کشاورزی مشهد و موسسه تحقیقات بیوتکنولوژی کشاورزی کرج جمع آوری شد آه شامل 25 ژنوتیپ مختلف زعفران - زراعی و وحشی - بود. استخراج DNA از برگ و به روش دلاپورتا 4انجام شد.واآنش زنجیره اي پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر در حجم 15 میکرولیتر انجام شد آه هر واآنش داراي 100نانوگرم از DNA ژنومی، 0/2 میلی مولار هرdNTP، 1/5میکرولیتراز PCR بافر - - 10X، 15 پیکومولاز هر آدام از آغازگرها، 2/5میلی مولارازMgCl2 و 1 واحد Taq پلی مرازبود. برنامه دوره های تکثیر DNA و دمای مورد استفاده به صورت زیر بود.

4 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد براي واسرشته سازي اولیه، 5 چرخه اولیه: 1 - دقیقه در 94 درجه سانتیگراد براي واسرته سازي، 1 دقیقه در دماي 35 براي چسبیدن آغازگر و 1 دقیقه در دماي 72 درجه براي بسط پلی مراز - ، 35 چرخه: 1 - دقیقه در 94 درجه سانتیگراد براي واسرته سازي، 1 دقیقه در دماي 50 براي چسبیدن آغازگر و 1 دقیقه در دماي 72 درجه براي بسط پلی مراز - و 4 دقیقه در دماي 72 درجه براي بسط نهایی استفاده شد. براي انجام الکتروفورز از دستگاه الکتروفورز عمودي ساخت شرآت Bio-Rad و ژل پلی آآریلامید واسرشته ساز 6 درصد استفاده شد.

الکتروفورز در یک میدان الکتریکی با شدت 90 ولت بمدت 1-1/5ساعت صورت گرفت. پس از پایان الکتروفورز، رنگآمیزي ژل با روش نیترات نقره انجام شد در تجزیه و تحلیل آماري میزان اطلاعات چندشکل5 نشانگرها معیاری برای قدرت تمایز هر جفت آغ ازگر ب ا اس تفاده از فرمول pi - PIC   1 − ∑in1 p i 2 فراوانی نشانگر i ام در ی ک ترآی ب آغ ازگري - ب ا اس تفاده از ن رم اف زارExel، گروهبندي ارقام ب ا اس تفاده از الگ وریتم Complete Linkage و ض ریب تش ابه تط ابق س اده و تجزی ه ب ه مؤلف ه اصلی - PCA - به عنوان روش مکمل براي تجزیه خوشه اي با استاده از نرم افزار NTSYS-pc 2.0 انجام شد.

نتایج و بحث:

10 ترکیب آغازگري اس.رپ براي بررسی ارتب اط ژنتیک ی گون ه وحش ی و زراع ی زعف ران م ورد اس تفاده قرارگرف ت. درمجموع 247 آلل مشاهده شد آه بیشترین تعداد مربوط به آغازگرEM4-ME4 ب ا 36 آل ل و کمت رین تع داد مرب وط ب ه جفت آغازگرEM1/ME5 با 19 آلل بود. میانگین تعداد آلل ها برابر با 27 /4 بود. از 247 آلل تعداد آلله ای چن د ش کل برای جمعیت وحشی 240 آلل 97/17 - در صد - و برای جمعیت زراع ی 32 آل ل 12/96 - در ص د - ب ود. ان دازه قطع ات DNA تکثیر شده از 100 تا 3000 جفت باز متغیر بود. همچنین جفت آغازگرEM1-ME5 داراي بیشترین مق دارPIC بود آه نشان دهنده کارایی بالای آنها درتمایز ژنوتیپ هاي مورد استفاده در این تحقیق بود.

تجزی ه خوش ه اي ب ر اس اس آلگ وریتم SM و ض ریب تش ابه complete linkage ب ا اس تفاده از داده ه اي مولک ولی، ژنوتی پ ه اي م ورد مطالع ه را در چه ار گ روه ق رار داد - ش کل. - 1 در گ روه اول نمون ه ه ای مرب وط ب ه گون ه ه ای C. speciosus و C. hausknechtii ق رار گرفتن د ک ه نش اندهنده ش باهت ب الای ای ن دو گون ه - %70 - ب ا یک دیگر می باشد. در گروه دوم نمونه های مختلف زراعی و در گروه سوم یک نمونه از گونه C. caspius و پنج نمونه از گونه C. cancellatus م ی باش د. نمون ه ه ای UNP1 وUNP2 ب ه دلی ل داش تن ش باهت ب الا - %95 - وش باهت ب ه گون ه C. - %70 - cancellatus به احتمال قوی مربوط به این گونه می باشند. گروه چهارم نیز شامل دو نمون ه C. speciosus، یک نمونه C. hausknechtii و 4 نمونه دیگر C. cancellatus می باشد.

با توجه به اینکه نمون ه ه ای ژنتیک ی داخ ل یک گونه دارای بیشترین شباهت و قرابت ژنتیک ی ب وده و اصولاً ب ا یک دیگر گروهبن دی م ی ش وند، ق رار گ رفتن گون ههای یکس ان در داخ ل گروهه ای مختل ف ممک ن اس ت در اث ر ج دایی میکروکلیم ایی باش د ک ه باعث روند تکاملی متفاوت در دو جهت مختلف شده است.تجزیه به محوره ای اص لی ب ر اس اس داده ه اي مولک ولی نمون ه ه اي م ورد مطالع ه را در4 گ روه مج زا ق رار داد ک ه تجزیه کلاستر را تأیید می کند و همانند تجزیه کلاستر نمونه های زراعی در یک گروه مج زا ق رار گرفتن د ک ه م ی تواند به دلیل تفاوت در ساختار ژنتیکی آنها با ژنوتیپ هاي وحشی باشد به خصوص اینکه نمونه های زراعی نس بت ب ه نمونه های وحش ی دیپلوئی د از س طح پلوئی دي ب الاتري برخ وردار م ی باش ند و م ی ت وان ب ه راحت ی ژنوتیپه اي دیپلوئی د را از تریپلوئید جداآردآه با نتایج بوداك - 1 - منطبق اس ت.

آن الیز تجزی ه ب ه محوره ای اص لی و تجزی ه خوش ه ای نش ان داد ک ه س طوح پلوئی دی قاب ل توزی ع اس ت توزی ع س طوح پلوئی دی ممک ن اس ت مرب وط ب ه اث رات محیط ی ی ا پیش رفت تک املی و تاریخی ژنوتیپها باشد - . - 3بن ابراین نش انگرهای مولک ولی ق ادر ب ه تفکی ک ژنوتیپه ای وحش ی از زراع ی م ی باش د و ب ا توج ه ب ه اینک ه SRAP توانسته آنها را در گروه جدا قرار دهد و همچنین تطابق تجزیه خوشه ای با تجزی ه ب ه مختص ات اص لی، ای ن نش انگر در شناسایی تنوع موجود بین نمونه هاي زراعی و وحشی زعفران از توانایی بیشتري برخوردار است.