بخشی از مقاله
مقدمه
سلولهاي میکروگلیا، سلولهاي ایمنی مستقر در سیستم عصبی مرکزي هستند که وظیفه تنظیم ایمنی طبیعی و دخالت در پاسخهاي ایمنی سیستم عصبی مرکزي را بر عهده دارند. در مغز بالغ سالم میکروگلیا در حالت استراحت دیده می شود که با خصوصیاتی چون جسم سلولی کوچک، استطاله هاي منشعب وبیان کم آنتی ژنهاي
سطحی همراه است. در پاسخ به آسیب مغز، ایسکمی و محرکهاي التهابی چون سیگنالهاي میکروبی، پروتئینهاي پاتولوژیکی، ATP خارج سلولی و فاکتورهاي سرمی، سلوهاي میکروگلیا فنوتیپ فعال به خود گرفته، قادر به تکثیر، سنتز نیتریک اکساید((NO، مهاجرت به محل آسیب دیده، فاگوسیتوز بقایاي سلولی و ترشح فاکتورهاي قابل
242
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
انتشار همچون سیتوکین ها، کموکاین ها، فاکتورهاي تروفیک و میانجیگرهاي التهابی اسید چرب مثل آراشیدونیک اسید، پروستاگلاندین هاي D2، E2 و F2α،
فاکتور فعال کننده پلاکتها، ترومبوکسان B2 و لوکوتري ان
B4 می باشند .(3)
بسیاري از عوامل محرك سلولهاي میکروگلیا و همچنین دسته وسیعی از آسیبهاي نورولوژیکی و بیماریها با القاي
iNOS و تولید NO مرتبط است(.(3 القاي iNOS
درسلولهاي میکروگلیا، توسط اندوتوکسین LPS مشتق شده از دیواره باکتریهاي گرم منفی که به عنوان اولین عامل محرك قوي سلولهاي میکروگلیا در مقالات علمی مطرح شد و نیزتوسط سیتوکین هاي معینی همچون اینترفرون گاما((INF-γ، فاکتور نکروز تومور آلفا((TNF-α یا اینترلوکین یک آلفا (IL-1α) که از طریق گیرنده هاي مشخصی در غشاي پلاسمایی عمل می کنند، صورت می پذیرد 3) و .(4 همچون سایر سلوهاي میلوئید، سلولهاي میکروگلیا با آزاد کردن مقدار زیادي از سیتوکین ها، کموکاین ها، گونه هاي فعال اکسیژن((ROS، پروتئازها و نیتریک اکساید((NO به LPS پاسخ می دهند. این اثرات از طریق رسپتورهاي TLR4، عضوي از خانواده TLR
میانجیگري می شود 3) و .(9 به نظر می رسد آنزیم iNOS
که وظیفه سنتز NO در سلولهاي میکروگلیا را عهده دار است، طی پاسخهاي التهابی توسط فاکتور نسخه برداري
NF-қB تنظیم می شود. اتصال LPS به رسپتور خود منجر به تخریب و آزاد شدن سریع مهار کننده این فاکتور یعنی
IқB شده، و انتقال NF-қB به داخل هسته منجر به تنظیم بیان بسیاري از ژنهاي درگیر در فرایند التهاب از جمله
iNOS می شود. نیتریک اکساید سنتز شده در نتیجه فعالیت این آنزیم به عنوان یک رادیکال آزاد قوي و با عملکرد یک پیامبر ثانویه مهم باعث پیشبرد وقایع التهابی می شود(.(8
نیتریک اکساید ضمن اینکه به عنوان یک گشاد کننده عروق و نیز یک نوروترانسمیتر می باشد، در غلظتهاي بالاتر با تشکیل پراکسی نیتریت و نیتروزیل دار کردن
پیامبر هاي سیگنال سلولی در تنظیم روند التهاب مؤثر است .(7) بنابراین ضمن اینکه NO داراي نقش فیزیولوژیکی در سیگنال سلولی نورونی است، اماسنتز بیش از حد آن باعث ایجاد بیماریهاي نورودژنراتیو می شود
.(14)
داروي نوظهور آیمود با منشاء گیاهی، ترکیبی از سلنیوم، کاروتن و فلاونوئیدهاست. با توجه به اثرات این دارو در کاهش میزان فاکتور نکروز تومور آلفا (TNF-α)، اینترفرون گاما (INF-γ) و اینترلوکین 2) (IL-2)2 و (11، بررسی اثرات این دارو در کنترل میزان نیتریک اکساید تولید شده توسط سلولهاي ملتهب میکروگلیا، می تواند نتایج رضایت بخشی به همراه داشته باشد.
مواد و روشها
کشت سلولهاي میکروگلیا: در کشت سلولهاي میکروگلیا از روش (5) Giulian & Baker استفاده گردید. کشت پرایمري سلولهاي میکروگلیا با استفاده ازمغز موشهاي صحرایی نوزاد 1 تا 4 روزه نژاد wistar انجام گردید. ابتدا پرده مننژ ازبافت کورتکس جدا شد و پس از خرد کردن سلولها به روش مکانیکی، سوسپانسیون سلولی حاصل به نسبت یک نیمکره در هر فلاسک (فلاسکهاي 25cm2، (Nunc، داخل محیط کشت Dulbecco’s ) DMEM ( Modified Eagle’s Medium حاوي 10 درصد ) FCS (Fetal Calf Serum قرار داده شد. سپس فلاسکها به مدت دو هفته در انکوباتور با دماي 37 درجه سانتی گراد و رطوبت مناسب و نیز میزان 5 درصد CO2 قرار گرفتند. در فواصل 5 روز، محیط رویی سلولها حذف و توسط محیط کشت سرم دار جدید جایگزین گردید. پس از گذشت حدود 10تا 14 روز از زمان کشت، انواع مختلفی از سلولهاي عصبی شامل نورونها و گلیاها (آستروسیت ها، الیگودندروسیت ها و میکروگلیا) درسطح فلاسک قابل رویت بودند )(1)شکل .(1
243
تیمار سلولها توسط LPS
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
شکل -1 سلولهاي میکروگلیا با جسم سلولی گرد و شفاف که بر سطح
سلولهاي آستروسیت نوع اول قرار گرفته اند. (میکروسکوپ فاز
کنتراست، بزرگنمایی (200
شکل-2 سلولهاي میکروگلیا یک هفته پس از کشت میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
خالص سازي سلولهاي میکروگلیا: جداسازي این سلولها بر اساس قدرت چسبندگی به سطح بستر است. با توجه به اینکه از میان سلولهاي گلیا، سلولهاي میکروگلیا داراي قدرت چسبندگی بالاتري هستند((16، لذا در مواجهه با تریپسین همچنان متصل به کف بستر باقی می مانند در صورتی که سایر سلولهاي گلیا ( آستروسیت ها و الیگودندروسیت ها) به صورت یک صفحه جدا می گردند.
در این روش ابتدا سطح فلاسک توسط بافر هنکس شستشو داده شد و سپس به نسبت 1 به 4 محیط کشت
DMEM و تریپسین 0/25 درصد (16) استریل به فلاسکها
اضافه گردید و به مدت 30 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد.
پس از این مدت سلولهاي دیگر به شکل ورقه اي از کف فلاسک جدا می گردند که این ورقه سلولی حاوي آستروسیت ها و الیگودندروسیت ها می باشد. در حالی که سلولهاي میکروگلیا همچنان به سطح فلاسک چسبیده باقی می مانند(.(1 براي جدا کردن سلولهاي میکروگلیا از سطح فلاسک، از Cell scrapper استفاده گردید. پس از رنگ آمیزي و شمارش ( حدود 10000 سلول در هر ول)،
سلولهاي میکروگلیا داخل پلیتهاي 96 تایی کشت داده شده و به مدت 24ساعت داخل انکوباتور انکوبه شدند.
و داروي آیمود: براي تیمار
سلولها از محلول ) LPS تهیه شده از شرکت دارویی سیگما) با غلظت 1μg / ml در محیط کشت DMEM
استفاده گردید. پس از تهیه رقتهاي مورد نیاز - 1/2000) (1/50 از داروي آیمود (با استفاده از آیمود و محیط کشت
(DMEM، جهت فعال سازي سلولها ازLPS استفاده گردید و سپس تیمارآنها توسط داروي آیمود صورت گرفت.
اندازه گیري میزان نیتریک اکساید: پلیتهاي 96 تایی حاوي سلولهاي میکروگلیا پس از تیمار به مدت 24 و 48
ساعت در انکوباتور قرار گرفتند و پس از گذشت این مدت، از انکوباتور خارج گردیده، ابتدا حدود 60
ماکرولیتر از سوپ سلولی از پلیتهاي مذکور خارج و به ویالهاي 1/5ml منتقل گردید و پس از سانتریفیوژ به مدت
10 دقیقه و دور 1500RPM، حدود 50μl از آن داخل پلیتهاي 96 تایی دیگري انتقال داده شدند. سپس حدود μl
50 معرف Griss (تهیه شده از شرکت دارویی سیگما) به هر ول اضافه گردید و میزان جذب توسط دستگاه الایزا ریدر((Microplate reader labsystem multiscan و در طول موج (16 ) 540 nm مورد بررسی قرار گرفت.
244
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
شکل-3 سلولهاي میکروگلیا پس از حذف سایر سلولها با استفاده از روش آنزیمی
میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
شکل-5 تست MTT سلولهاي میکروگلیا در حضور LPS و
محیط کشت DMEM پس از 48 ساعت میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
شکل -7 سلولهاي میکروگلیا تیمار شده باLPS و رقت 1/1500 آیمود پس از 48 ساعت میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
245
شکل-4 اثر (1μg / ml )LPS بر سلولهاي میکروگلیا میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
شکل-6 سلولهاي میکروگلیا تیمار شده با LPS و رقت1/50 آیمود
میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
شکل -8 سلولهاي میکروگلیا تیمار شده
با LPS ورقت 1/2000 آیمود پس از 48 ساعت میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
شکل -9 تست MTT سلولهاي میکروگلیا در حضورLPS شکل -10 تست MTT سلولهاي میکروگلیا در محیط
و رقت 1/2000 آیمود پس از 48 ساعت کشت DMEM و FCS پس از 48 ساعت
میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200 میکروسکوپ فاز کنتراست، بزرگنمایی 200
