بخشی از مقاله
مقدمه
آفت کشها نقشی مهمی در کشاورزي مدرن و تولید غذا (در میتوکندري قارچها) مهار میکند .(20) سوکسینات
دارند. با این وجود مصرف بی رویه آنها منجر به آلودگی دهیدروژناز یک آنزیم کلیدي در چرخه کربس و زنجیره
محیط زیست شده است 4)و.(6 کاربوکسین 2)و3 دي انتقال الکترون میباشد. مطالعات مولکولی ساختاري نشان
هیدرو--5کاربوکسانیلیدو--6متیل 1و4 –اگزاتین، داده که کاربوکسین از محل اتصال یوبی کویتین به آنزیم
ویتاواکس) یکی از چند ترکیب قارچ کش شیمیایی است سوکسینات دهیدروژناز متصل شده و فعالیتهاي اصلی
که براي کنترل قارچهاي بیماریزاي گیاهان زراعی از آن میتوکندري را سرکوب میکند 9) و .(17 در مورد اثر سمی
استفاده می شود. قدرت قارچ کشی ترکیبات اگزاتیین در کاربوکسین بر سلولها و جنین، اطلاعات بسیار محدودي در
سال 1966 نشان داد که کاربوکسین در موجودات مختلف دسترس است. مطالعات نشان داده که این ترکیب با مهار
مکانیسم تأثیر متفاوتی دارد. رشد مخمر ها را از طریق سنتز پروتئین از رشد مخمر جلوگیري میکند (8) از سوي
سرکوب سنتز پروتئینها (8) و مهار اکسیداسیون سوکسینات دیگر یک ترکیب فعال نوري است که در اثر تابش نور
298
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
خورشید بر محلول آبی آن، تولید سولفوکسید و برخی ترکیبات دیگر میکند که تأثیرات سمی آنها بر دافنی، روتیفر و تعدادي از سخت پوستان مورد بررسی قرار گرفته است .(5) از سوي دیگر، جنین جوجه مدل مفیدي براي مطالعه تأثیر سموم وداروها بر تکوین جنینی است. به راحتی قابل دسترس و داراي هزینه بسیار پایین بوده و جانشین خوبی براي تعمیم در پستانداران محسوب میشود(.(13 در این تحقیق تأثیر تراتوژنیک سم کاربوکسین بر جنین جوجه بررسی و میزان مقاومت سلولهاي کبدي نسبت به آن در شرایط آزمایشگاهی مورد مطالعه قرار گرفته است.
مواد و روشها
تیمار جنین جوجه : تخم مرغهاي بارور نژاد راس (Ross)
از شرکت آرتا جوجه خریداري و در دماي 10±1 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 65±5 درصد نگهداري شدند.
ترکیب قارچ کش کاربوکسین 5) و 6 دي هیدرو--2 متیل
1- و -4 اگزاتین -3- کاربوکسانیلید) با درجه خلوص 98
درصد از شرکت گیاه تهران تهیه گردید. 50 میکرولیتر سم محلول در استون و با غلظتهاي 20، 100، 200 و400
میکروگرم / تخم مرغ ، در روز صفر انکوباسیون و در شرایط استریل با استفاده از سرنگ هامیلتون از قسمت کیسه هوا به کیسه زرده تخم مرغها (n= 7) تزریق شد.
بلافاصله محل تزریق توسط پارافین مذاب بسته و سپس تخم مرغها در دماي 37/7 – 38 درجه سانتی گراد و رطوبت نسبی 65 درصد در انکوباتور نگهداري شدند. به گروه شم 50 (n= 7) میکرولیتر استون (حلال) تزریق گردید. در هر تکرار یک گروه از تخم مرغها به عنوان کنترل همزمان با گروه تیمار و شم گرماگذاري گردید.
جهت کنترل رشد جنینی در طول انکوباسیون، به طور متوسط 4 بار کندلینگ انجام گرفت. این آزمایشها در چهار تکرار اجرا شد.
بررسی سمیت و خصوصیات تراتوژنیک کاربوکسین:
تخم مرغهاي تیمار شده و شم، در روز 19 انکوباسیون باز و توزین شدند. میزان مرگ و میر آنها ثبت و با فرمول زیر درصد تلفات محاسبه گردید و ناهنجاریهاي ظاهري قابل تشخیص بررسی و ثبت گردید(.(3
)] ×100در صد تلفات شم-)/(100 در صد تلفات شم- در صد تلفات تیمار)= [ در صد تلفات
براي بررسی ناهنجاري اسکلتی، پوست جنین جدا و محتویات شکمی تخلیه گردید و به مدت 3 روز در محلول هیدرواکسید پتاسیم 2) درصد) قرار گرفت. سپس، جنینها در محلول هیدرواکسید پتاسیم 1) درصد) حاوي الایزارین 0/1) درصد) به مدت3 روز رنگ آمیزي گردید.
شفافسازي نهایی با قراردادن جنین در گلیسرول انجام شد
2)و.(4
بررسی سمیت سلولی کاربوکسین بر سلولهاي کبدي
جنین: براي بررسی اثرات سایتوتوکسیسیتی، کبد جنین 12
روزه جوجه استخراج و پس از تیمار با آنزیم تریپسین در محیط کشت RPMI (در پلیتهاي 24 خانه) قرار گرفت.
پس از 24 ساعت، سلولها در فاز رشد با غلظتهاي 5 ،10، 25، 50 و 100 میکروگرم/میلی لیتر براي 16 ساعت تیمار و درصد سلولهاي زنده به وسیله آزمون سنجش احیاي فورامازون بررسی شدند .(18) در سلولهایی که از لحاظ متابولیکی فعال هستند، ترکیب MTT در حضور سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریاي احیاء شده به شکل کریستال نا محلول فورامازون در میآید که شدت تولید کریستال نشان دهنده حیات سلول میباشد. بدین منظور، محیط کشت سلولهاي تیمار شده خارج و محیط کشت تازه حاوي 10 در صد محلول MTT (محلول 5 میلیگرم در میلیلیتر در بافر فسفات 0/1 مولار با (pH: 7/4 به چاهکها اضافه شد. به مدت 3 ساعت در 37 درجه سانتی گراد و در شرایط تاریکی گرماگذاري گردید. کریستالهاي ایجاد شده در DMSO حل و جذب آنها در طول موج 570
299
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
نانومتر ثبت گردید. مقدار IC50 به عنوان غلظتی از سم در اختلاف میانگین وزن بین نمونههاي تیمار شده و شم نشان
نظر گرفته شد که باعث 50 درصد کاهش در جذب نوري داد که اختلاف قابل ملاحظه اي حتی در بالاترین غلظت
میگردد و میزان درصد سلولهاي زنده از رابطه در بین تیمارها از نظر وزن جنین بروز نمیکند.
"شم/ODتیمار"OD محاسبه گردید(.(19
نتایج
تزریق غلظتهاي مختلف سم کاربوکسین با حجم ثابت
نشان داد که با افزایش غلظت از 20 تا 400 میکروگرم /
تخم مرغ در روز صفر انکوباسیون (در داخل زرده) افزایش
قابل توجهی در مرگ و میر دیده میشود، به طوري که در
غلظتهاي 400، 200، 100 و20 میکروگرم به ترتیب 33/6،
38/9، 56 و61 درصد از جنینها زنده ماندند. به عبارت شکل -1 مقایسه درصد بقاء جنین جوجه تیمار شده با غلظتهاي
دیگر افزایش غلظت سم باعث افزایش مرگ و میر گردید.
مختلف کاربوکسین، با استفاده از اختلاف بین درصد بقاء گروه شم با
اختلاف کسر بقاء بین گروه شم و هر یک از غلظتهاي به
گروههاي تیمار معنیدار میباشد و میزان بقاء جنین وابسته به غلظت
کار رفته در سطح 5 درصد معنی دار بود. اما تعقیب
سم میباشد. (در هر ستون حروف مشترك، نشان دهنده معنی دار
اختلاف بین غلظتهاي مختلف نشان داد که این اختلاف در نبودن نتایج بین گروهها است. P≤0.05، .(mean±SE
سطح 5 درصد معنی دار نمی باشد (شکل .(1 بررسی
الف ب
شکل -2 ناهنجاري از نوع پا چنبري در جنین جوجه 19 روزه تیمار شده با 200 میکروگرم / تخم مرغ (ب) و جنین شم (الف
