بخشی از مقاله
مقدمه
حبوبات نقش مهمی در تامین نیازهای غذایی جامعه بشری به ویژه در کشورهای در حال توسعه ایفاء می کنند. دربین حبوبات تخود از نظر سطح زیر کشت در مقام چهارم جهان قرار دارد. سهم تولید نخود در ایران معادل ۱/۴ درصد تولید جهانی نخود است که حدود ۵۵ درصد آن محدود به استانهای نواحی غرب کشور است (۱۲). افزایش عملکرد نخود در ایران از پیشرفت کمی برخوردار بوده است که می توان با افزایش تنوع و انجام تلاقی های لازم این مشکل را حل کرد (۲۷). برای اصلاح ارقام نخود و نیز نگهداری و حفظ ذخائر توارثی آن بررسی تنوع موجود بین ارقام نخود از اهمیت ویژهای برخوردار است (۵، ۲۲، ۲۵). شناسایی تنوع ژنتیکی به نژادگران را در امر شناسایی والدین برای انجام تلاقی های مطلوب یاری میرساند (۱). در گذشته بررسی تنوع نتیکی در گیاهان به وسیله تجزیه صفات مورفولوژیکی و یا بیوشیمیایی انجام میشد. از آنجائی که فنوتیپ تحت تاثیر محیط قرار می گیرد، لذا تعیین تنوع ژنتیکی به همراه روشهای مولکولی چشم انداز نوینی را برای ارزیابی تنوع زیستی فراهم آورده است (۲۰،۹، ۲۳). یکی از نشانگرهای مولکولی جهت بررسی تنوع موجود بین ارقام، نشانگر RAPD است که از قدرت مناسبی برای بررسی چند شکلی بین ارقام برخوردار است(۱، ۲، ۱۹، ۲۲). این تکنیک در سال ۱۹۹۰ توسط William, Kubelik به کار رفت. HII و Carlos در سال ۱۹۹۱ هفده جمعیت نخود وحشی و زراعی را براساسی ویژگی های مورفولوژیکی، الوزایمها و نشانگر RAPD مورد تجزیه قرار دادند و در نهایت همبستگی نزدیکی بین گونه های وحشی و زراعی گزارشی نمودند. DaViS در سال ۱۹۹۵ بیان داشت که RAPD نسبت به آلوزایم ونشانگرهای پروتئینی از حساسیت بیشتری برای تعیین تنوع برخوردار یجی توسط Gaur و Slinhard در سال ۱۹۹۰ (۱۴) روی نخود نیز گزارش شده است. Weeden در سال ۱۹۹۲ و نیز Shamma با استفاده موفقیت آمیز تکنیک RAPD سطح بالایی از پلیمرفیسم را در ارقام نخود ایرانی گزارش نمودند.
هدف از این تحقیق بررسی تنوع صفات کمی بین لاین های نخود، ارزیابی لاین های مقاوم به کمبود اب و بررسی پلی مورفیسم ژنتیکی لاین های نخود ایرانی استفاده از نشانگرهای ریخت شناختی و مولکولی RAPD می باشد.
مواد و روشها
به منظور بررســي تنوع ژنتيکي و شناسايي چند شکلي مولکولي تعداد ۲۱ لايــن نخود در قالــب طرح بلوکهاي کامل تصادفي با ســه تکرار در دو شــرايط آبي و ديم در مزرعه تحقيقاتي دانشــکده کشاورزي دانشگاه رازي مــورد آزمايــش قرار گرفتند. کاشــت بذور به صورت دســتي در فروردين مــاه ۱۳۷۷ انجام گرفت . فاصلــه بين رديف ها ۵۰ ســانتي متر، فاصله بين بذور بر روي رديف ۱۰ ســانتيمتر و عمق بذر حدود ۵ ســانتي متر در نظر گرفته شــد. هر رقم در دو رديف کشــت گرديد و بر روي هر رديف تعداد ۱۲ عدد بذر مورد اســتفاده قرار گرفت . در کشــت آبي سه نوبت آبياري صورت گرفت و در کشــت ديم هيچ گونه آبياري صــورت نگرفت . هنگامي که ۹۰ درصد بوته ها رســيد برداشــت صورت گرفت و عملکرد آبي (Yp) و ديم (Ys) بدست آمد.
در آزمايــش مولکولي ، کليه لاين ها در گلدان هاي پلاســتيکي کشــت گرديدند و براي مدت ســه هفته در اطاقک رشــد با دوره روشــنايي ۱۳.۵ ســاعت با درجه حرارت ۲۵ درجه سانتي گراد و دوره تاريکي ۱۰.۵ساعت با درجه حرارت ۱۵درجه ســانتي گراد قرار گرفتند. به منظور استخراج DNA ، مقدار۰.۱ گرم از بافت ليوفيليزه شــده را در ازت مايع به پودر نرم تبديل نموده و ۳۰۰ ميکرو ليتر بافر استخراج به آن اضافه گرديد و DNA ژنومي آن به روش Dellaporta (۱۱) اســتخراج گرديد. DNA به دســت آمده در ۳۰ ميکروليتر آب مقطر اســتريل حل شده و در ۲۰- درجه سانتي گراد نگهــداري گرديــد. در اين تحقيق از ۵ آغازگر به شــرح جدول ۱ اســتفاده گرديد.
واکنش زنجيــره پليمر از (PCR) در حجــم ۵۰ ميکروليتر که حاوي ۵ واحــد آنزيــم Taq DNA polymerase ۴۰ نانوگــرم DNA ژنومــي ، ۹۰ نانوگرم آغازگــر، ۰.۴ميلي مولار dNTPs، ۲ ميلي مــولار MgCl۲ ، ۵ ميکروليتــر بافــر(x ۱۰) صورت گرفت . قبل از انتقال نمونه ها به دســتگاه ترموســايکلر (Maxi-Gene,UK) هــر يک با يک قطــره از روغن پارافين پوشش داده شد. سپس واکنش براي ۳۵ دور، هر دور شامل يک و نيم دقيقه در ۹۰ درجه ، يک و نيم دقيقه در۳۱ درجه ، يک و نيم دقيقه در ۷۲ درجه انجــام گرديد. بعــد از تمام ۳۵ دور، واکنــش در ۷۲ درجه به مدت ۴ دقيقه قرارگرفــت . محصــول PCR روي ژل آگارز ۱.۵ درصــد الکتروفورز گرديد.
نمونه ها پس از رنگ آميزي با اتيديوم برومايد توســط اشــعه ماوراء بنفش ملاحظه و عکس برداري گرديد.
محاسبات آماري
ابتدا با استفاده از فرمول Fernandez براي کليه ژنوتيپها شــاخص تحمل تنش (STI) گردید .
که در آن Yp عملکرد ژنوتيپ ها در شــرايط آبي Ys عملکــرد ژنوتيپ هــا در آزمايش ديــم و Yp ميانگيــن عملکرد کليه ژنوتيپ ها در محيط بدون تنش است . سپس براي Ys ،Yp و STI تجزيه واريانــس صورت گرفت و با اســتفاده ازنرم افزار آماري SPSS و ترســيم نمودار سه بعدي ژنوتيپ ها از نظر مقاومت به تنش گروه بندي شدند. سپس با اســتفاده ازاين ســه معيار و تجزيه خوشــه اي با روش UPGMA تنوع ژنتيکي بين ارقام مشــخص شد. در بخش مطالعات مولکولي ، دندورگرام به روش UPGMA و براســاس مهاجرت هاي باندي و برمبناي ضريب تشــابه Nei و ضريب فاصله اقليدسي (۶) رسم گرديد. سپس اين دو روش با هم مقايسه شدند و همبستگي بين آنها تعيين گرديد.
که در آن N تعداد باندهاي مشترک بين دو فرد A و B و NA و NB به ترتيب تعداد باند توليد شده توسط دو فرد است . پس از تجزيه واريانس ، ميانگين هــا به روش دانکن مقايســه و گروه بندي شــدند و ضريب تغييرات فنوتيپي و ژنوتيپي نيز محاسبه گرديد (۶).
