بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق 7 نشانگر مولکولی SSR جهت بررسی تنوع ژنتیکی میان 89 ژنوتیپ امیدبخش برنج و 2 رقم پوکالی - شاهد متحمل - و IR29 - شاهد حساس - استفاده گردید.این نشانگرها بین والدین و ارقام شاهد چندشکلی نشان داده و قادر به تفکیک ژنوتیپ ها بودند. حداقل و حداکثر درجه چند شکلی - PIC - به ترتیب در نشانگرهاي - 0/360 - RM261 و - 0/375 - RM315 دیده شد.
هم چنین کم ترین میزان هتروزیگوسی مکان ژنی - صفر - و حداکثر میزان آن - 0/23 - به تریتب در نشانگرهاي RM5 وRM493 تعیین گردید. تجزیه کلاستر با استفاده از ضریب تشابه SM به روش UPGMA انجام گرفت و بر اساس دندروگرام حاصل نشان داد که ژنوتیپ ها در 2 گروه قرار گرفتند. گروه اول 40 درصد ژنوتیپ ها را به همراه شاهد متحمل - پوکالی - در بر گرفت و گروه دیگر سایر ژنوتیپ ها و شاهد حساس را در یک گروه قرار داد که بیان می کند این 2 گروه از نظر ژنتیکی با هم متفاوت می باشند.
ژنوتیپ طارم نوك سیاه در گزینش توسط نشانگرهاي مولکولی - MAS - و در تجزیه خوشه اي - با بیشترین شاخص تشابه - SI = 1/00 - با شاهد متحمل - به عنوان ژنوتیپ متحمل به شوري شناخته شد. پیشنهاد می گردد که نشانگر RM493 با میزان بالاي هتروزیگوسی و کارایی تفکیک ژنوتیپ ها و نیز میزان بالاي درجه چند شکلی - PIC = 0/370 - ، جهت ارزیابی تنوع ژنتیکی تحمل به شوري در لاین ها و ارقام امید بخش برنج به عنوان نشانگري ممتاز قابل استفاده می باشد.
مقدمه
شوري یکی از رایج ترین و مسأله سازترین تنش هاي زیستی در مناطق کشت برنج در دنیا می باشد 12 - و . - 4 گیاه برنج در مرحله جوانه زنی به شوري نسبتا متحمل و در اوایل دوره گیاهچه اي 3 - برگی - خیلی حساس شده و مجددا در مرحله رشد رویشی مقاوم می گردد. در مرحله گرده افشانی و لقاح نیز به شوري حساس شده و در مرحله رسیدن بطور فزاینده اي مقاومتر می گردد
موفقیت هاي بدست آمده در گذشته به دلیل پیچیدگی کار براي اصلاح تحمل به شوري - - 5، فقدان احساس ضرورت و فوریت واقعی براي اصلاح آن، تنوع ژنتیکی ناکافی براي تحمل به شوري، پیچیدگی اثرات متقابل شوري با عوامل محیطی و فقدان تکنیک هاي گزینشی کارآ، چندان قابل توجه نبوده است
انگیوین و همکاران - 11 - - 2001 - ، دریافتند که تحت EC برابر با 18 دسی زیمنس در متر، نشانگر RM315 با آلل هاي تحمل به NaCl همبستگی داشته و ژن هاي تنش شوري روي کروموزوم هاي 1 و 8 واقع می باشند. همچنین لانگ و همکاران - 7 - - 2001 - ، دریافتند که نشانگر RM223دقیقاًبا ژن هاي تحمل شوري در برنج روي کروموزوم 8 پیوسته می باشد. هدف از اجراي این تحقیق، گزینش مولکولی لاین هاي امید بخش برنج از نظر تحمل به شوري، ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ هاي برنج از طریق نشانگرهاي ریزماهواره و شناسایی و معرفی ژنوتیپ هایی با منابع جدید تحمل به شوري می باشد.
مواد و روش ها
مواد گیاهی
تعداد 11 رقم زراعی برنج - ندا، فجر، ساحل، سپیدرود، سنگ طارم، طارم نوك سیاه، حسنی، دیلمانی، شصتک محمدي، IRRI-1 ، - IRRI-2 و 78 لاین امیدبخش - نسل - F8 به همراه دو رقم پوکالی - شاهد مقاوم - و IR29 - شاهد حساس - - 11 - ، در مزرعه پژوهشی دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی ساري در سال 1388 کشت گردیدند.
واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - و الکتروفورز ژل آگارز
استخراج DNA ژنومی به روش CTAB صورت پذیرفت . - 3 - ارزیابی کمی و کیفی دي.ان.اي توسط ژل آگارز و روش اسپکتروفتومتري انجام گردید. 7 نشانگر چندشکل ریزماهواره مورد استفاده قرار گرفتند. واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - به حجم 20 میکرولیتر، 1 - میکرولیتر محلول دي.ان.اي، 14/5 میکرولیتر آب مقطر یون زدایی شده، 2 میکرولیتر بافر 10x پی سی آر، 0/5 میکرولیتر محلول 10 میلی مولار dNTP، 0/8 میکرولیتر محلول 50 میلی مولار MgCl2 ، 0/5 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهاي 10 میکرو مولار جلوبر و عقب بر و 0/2 میکرولیتر آنزیم تک پلیمراز - 5U/µl - از طریق دستگاه ترموسایکلر به شرح زیر تنظیم و انجام پذیرفت
یک چرخه به مدت 5 دقیقه در دماي 94 درجه سانتی گراد به منظور واسرشته سازي اولیه، 35 چرخه و هر چرخه شامل دماي 94 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه به منظور واسرشته سازي، دماي 55 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه به منظور اتصال آغازگرها، 72 درجه سانتی گراد بمدت 2 دقیقه جهت تکثیر و مرحله نهایی شامل 1 چرخه به مدت 7 دقیقه در دماي 72 درجه شسانتی گراد. تفکیک فرآورده هاي حاصل از تکثیر روي ژل آگارز 4 درصد صورت گرفت. رنگ آمیزي با محلول اتیدیوم بروماید با غلظت 10 میلی مولار انجام شد.
آنالیز داده ها
براي محاسبه فراوانی آللی و هتروزیگوسی قابل مشاهده براي هر مکان ژنی از برنامه - 9 - Power Marker ver 3.25 استفاده شد. مقادیر درجه چندشکلی - PIC - ، به عنوان هتروزیگوسی قابل انتظار براي باندهاي چندشکلی، با توجه به فرمول زیر و با استفاده از نرم افزار Power marker ver 3.25 محاسبه گردید.
که Pij فراوانی j امین آلل از نشانگر i می باشد و مجموع حاصل براي n آلل موجود بسط می یابد . - 1 - پیوستگی ژنتیکی بین ژنوتیپ ها بر اساس ضریب تشابه SM و ماتریس تشابه داده ها با استفاده از نرم افزار - NTSYS-pc 2.20L - محاسبه گردید. ماتریس تشابه حاصل جهت ساختن دندروگرام با استفاده از روش SAHN و براساس روش UPGMA به کار برده شد.
نتایج و بحث
گزینش مولکولی ژنوتیپ هاي متحمل
در این مطالعه ارقام طارم نوك سیاه - فراوانی 100 درصد - و دیلمانی - فراوانی 85 درصد - توسط نشانگرهاي RM5، RM9، RM493، RM223، RM315 و RM261، به عنوان محتمل ترین ارقام واجد ژن شوري در میان والدین شناخته شدند و طارم نوك سیاه توسط همه نشانگرهاي مولکولی به عنوان والد متحمل شناخته شد.
چندشکلی نشانگرهاي ریزماهواره
همه جفت نشانگرهاي استفاده شده در این مطالعه - RM9, RM5, RM23, RM261, RM493, RM223, RM315 - باندهاي چندشکل - پلی مورف - ایجاد کردند. درجه چند شکلی - PIC - از 0/348 تا 0/375 متغیر بود که متوسط آن 0/366 بود و بالاترین مقدار چند شکلی به نشانگرهاي - 0/375 - RM315 تعلق داشت در حالیکه نشانگر RM9 با 0/348 پایین ترین میزان چند شکلی را به خود اختصاص داد. هتروزیگوسی مکان هاي ژنی در بین نشانگرها، از صفر در RM5 تا 0/23 در RM493 و با میانگین 0/05 محاسبه شد.
تجزیه خوشه اي و چند شکلی DNA
تجزیه کلاستر ژنوتیپ ها را دو گروه اصلی قرار داد . در گروه اول 37 ژنوتیپ و در گروه دوم 54 ژنوتیپ قرار گرفتند. ژنوتیپ هاي شاهد مقاوم پوکالی و IR29 هرکدام به ترتیب در گروه 1 و 2 و در زیرگروه هاي دوم گروه خود قرار گرفته اند که به این ترتیب رقم والدینی طارم نوك سیاه که داراي بیشترین قرابت به رقم بسیار متحمل پوکالی می باشد به عنوان ژنوتیپی متحمل به شوري معرفی می گردد. در گروه اول دندروگرام حاصله، از میان ژنوتیپ هاي والدینی ارقام حسنی، سنگ طارم، شصتک و طارم نوك سیاه با رقم شاهد مقاوم پوکالی شباهت بیشتري دارا می باشند
