بخشی از مقاله
خلاصه
امروزه نشانگرهاي مولکولی مختلفی به منظور مطالعات پایهاي و یا کاربردي مورد استفاده قرار میگیرند. از کاربردهاي مهم نشانگرهاي مولکولی میتوان به استفاده گسترده در انگشت نگاري، اینترگرسیون آلل ها وانتخاب صفات مفید و تهیه نقشه هاي ژنتیکی در برنامه هاي به نژادي محصولات را اشاره کرد. نقشههاي ژنتیکی با پوشش بالاي ژنوم نقش بسزایی در تحقیقات پایه و کاربردي ژنتیک از جمله ردیابی ژنهاي مفید ایفا میکنند . این تحقیق به منظور تهیه نقشه پیوستگی ژنتیکی گلرنگ زراعی با نام علمی Carthamus tinctorius L. با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD انجام شد. نشانگر RAPD از تکثیر بالایی برخوردار می باشد و نیاز به اطلاعات اولیه در مورد ردیف DNA براي طراحی و ساخت آغازگر ندارد. جمعیت F2 استفاده شده در این مطالعه شامل 117 گیاه از نتاج حاصل از تلاقی بین گونهاي گلرنگ زراعی با نام C111 و یک ژنوتیپ وحشی از گونه C. oxyacanthus به نام ISF2 بود.
DNA هرکدام از گیاهان F2 و والدین به روش CTAB استخراج شد و در واکنش PCR به منظور تکثیر باندهاي چند شکل مورد استفاده قرار گرفت. . از کل 91 آغازگر RAPD آزمایش شده در این تحقیق، 16 آغازگر در بین والدین چند شکلی نشان دادند و در مجموع 81 نشانگر تکثیر شد که - %39/5 - 32 نشانگر انحراف از تفرق 3:1 را نشان دادند و مابقی نشانگرها 49 - نشانگر - با استفاده از نرم افزار Mapmaker/EXP Ver 3.3 با معیار حداکثر فاصله 50 سانتی مورگان و حداقل LOD برابر 3 به 6 گروه پیوستگی به طول 1225/5 cM شامل 39 نشانگر پیوسته و 10 نشانگر ناپیوسته تفکیک شدند . با اشباع شدن نقشه ژنتیکی ممکن است بتوان ژن هاي صفات مهم زراعی در گلرنگ را شناسایی و جداسازي نمود و به ارقام زراعی دیگر منتقل کرد.
کلمات کلیدي: گلرنگ زراعی، گلرنگ وحشی، نقشه پیوستگی ژنتیکی، نشانگر RAPD
مقدمه
گلرنگ با نام علمی Carthamus tinctorius، یک گیاه دانه روغنی مهم کشورهاي مناطق گرم و خشک است. این گیاه متعلق به جنس Carthamus و خانواده Compositae یا Asteraceae می باشد. بیش از 60 کشور دنیا به کشت گلرنگ میپردازند اما بیش از نیمی از کشت گلرنگ در کشور هند با سطح زیر کشت 363 هزار هکتار قرار دارد. کشورهاي دیگر تولید کننده گلرنگ، آمریکا، مکزیک،اتیوپی،آرژانتین و استرالیا می باشند. در سراسر جهان گلرنگعمدتاٌ به منظور استحصال روغنهاي خوراکی جهت آشپزي، روغن سالاد و کره هاي گیاهی کشت میشود. در کشور هاي پیشرفتهاي که تحقیقات بیشتري در مورد بهداشت و رژیم غذایی انجام میگیرد، تقاضا براي روغنهایی که بالاترین نسبت اسید هاي چرب غیر اشباع به اشباع را دارند روبه افزایش است . از این نظر، روغن گلرنگ مشابه روغن زیتون بوده و ضمن دارا بودن مقادیر بالاي اسید لینو لئیک و اسید اولئیک قیمت کمتري نیزدارد.
اسید هاي چرب غیر اشباع با یک پیوند دوگانه مانند اسید اولئیک باعث کاهش کلسترول مضر خون شده بدون اینکه اثري بر روي کلسترول مفید خون داشته باشند - - 1جنس 15 Carthamus گونه دارد که گروهبندي هاي مختلفی براي گونه هاي این جنس انجام شده است. بر اساس گروهبندي Vilatersana و همکاران 11 - و - 12 که براساس تعدادکروموزوم و روابط فیلوژنتیکی می باشد سه گروه شامل Carthamus - n=12 - ، 10 - وOdonthagnathis - n=11 و 22 - و32وAtractyliscan - n= وجود دارد. گونههاي دیگري از جنس گلرنگ همانند C. nitidus وجود دارند که در گروه بندي مشخصی قرار ندارند. این گروه نامشخص از گونه هاي مختلفی با تعداد کروموزوم هایی مثل 10و12و22 وn =32 تشکیل شده است. به طور معمول گونههایی باn=12 وn=10 ، گونه هاي خویشاوند گلرنگ می باشند و از اجداد اولیه گلرنگ محسوب می شوند.
محتواي روغن و عملکرد پایین گلرنگ در رابطه با سایر گیاهان دانه روغنی، از گلرنگ یک رقابت کننده ضعیف ساخته است و موفقیت این گیاه به عنوان محصول دانه روغنی تجاري به طور گسترده اي بستگی به بهبود عملکرد ومحتواي روغن آن دارد. در ایران که یکی از مراکز اصلی تنوع ژنتیکی گونه اهلی و گونههاي وحشی گلرنگ است برخی گونههاي گلرنگ همانند C. oxyacanthus با پراکنش در سراسر کشور، تنوع زیادي دارند و باحتمالاًتوان از آنها در اصلاح گلرنگ و افزایش توسعه کشت آن استفاده نمود. همچنین پژوهشها نشان دهنده قرابت نزدیک گونه C. oxyacanthus با گونه اهلی گلرنگ - C. tinctorius - است و ممکن است بتوان با تلاقی بین گونهاي گلرنگ اهلی و گلرنگ وحشی، ژن هاي مطلوب را به گلرنگ اهلی انتقال داد - 10 - نشانگرهاي مولکولی استفاده زیادي در اصلاح گیاهان دارند.
از کاربردهاي مهم نشانگرهاي مولکولی میتوان به استفاده گسترده در انگشت نگاري، اینترگرسیون آلل ها وانتخاب صفات مفید و تهیه نقشه هاي ژنتیکی در برنامه هاي بهنژادي محصولات اشاره کرد - 3،. - 8 پیشرفت هاي بسیاري در زمینه تهیه نقشه هاي ژنتیکی با استفاده از نشانگر هاي مولکولی بویژه در محصولاتی مثل برنج، ذرت، سورگوم و گندم وجود دارد ولی در گلرنگ که محصول نواحی خشک است در این مورد مطالعه زیادي انجام نشده است. مطالعه حاضر به منظور تهیه اولین نقشه مولکولی گلرنگ با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD می تواند آغازي در زمینه تهیه نقشه ژنتیکی گلرنگ باشد - 2و. - 8
مواد و روش ها
الف - مواد گیاهی
در این پژوهش تعداد 117 ژنوتیپ F2 حاصل از تلاقی بین گونهاي یک ژنوتیپ گلرنگ زراعی Carthamus tinctorius به نام C111 - بدون خار، داراي بذر سفید و گل قرمز و به عنوان والد مادري - و یک نمونه از گلرنگ وحشی C. oxyacanthus به نام ISF2 - خاردار وداراي رنگ بذر قهوه اي وگل زرد رنگ به عنوان والد پدري - به همراه والدین در گلخانه کشت گردیدند و نمونه هاي برگی به منظور استخراج DNA در مرحله 4 برگی از آن ها گرفته شد. روش تلاقی بین گونه اي توسط سبزعلیان و همکاران تشریح شده است - . - 9
ب - استخراج DNA ژنومی و انجام PCR
نمونه هاي برگی از برگ هاي جوان والدین و F2 که به اندازه کافی رشد کرده وتوسعه یافته بودند، تهیه گردید و استخراج DNA ژنومی با استفاده از روش موري و تامسون - 1980 - صورت گرفت - . - 7 کمیت و کیفیت DNA با استفاده از ژل آگارز %0/7 انجام شد. براي انجام واکنش زنجیره اي پلیمراز، ابتدا از 91 آغازگر RAPD براي تعین آغازگرهایی که تولید نشانگرهاي پلی مورف دربین دو والد میکنند استفاده شد. سپس از آغازگرهایی که چندشکلی کافی دربین والدین ایجاد کرده بودند براي انجام PCR اصلی و تهیه نقشه ژنتیکی استفاده شد. واکنش PCR بر اساس روش یانگ و همکاران - - 13 در دستگاه ترموسلیکلر Eppendorf انجام شد. واکنش حاوي 10ng از DNA، 1/5 میکرولیتر بافر PCR، 1/5 pM از آغازگر، MgCl2 2mM ، 0/2 از هرکدام از نوکلئوتیدهاي dNTP ها، یک واحد ازآنزیم Taq DNA polymerase و 7/9 ml آب مقطر بود.
ج-تجزیه و تحلیل پیوستگی ژنتیکی نشانگرها
دادههاي مربوط به هر ژنوتیپ F2 به صورت حضور و عدم حضور باند ثبت گردید. داده هاي حاصل به منظور تعیین گروههاي لینکاژي با استفاده از نرم افزار MAP MAKER 3 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند - . - 5 این نرم افزار با استفاده ازLOD=3 و تابع نقشه یابی Kosambi گروههاي لینکاژي باندهاي بدست آمده و فواصل بین آنها را تعیین کرد - . - 4
نتایج و بحث
از کل 91 آغازگر RAPD آزمایش شده، 16 آغازگر در بین والدین چندشکل بودند و براي انجام PCR در بین117 نتاج F2 استفاده شدند. این 16 آغازگر 81 نشانگر تکثیر کردند که - %39/5 - 32 نشانگر انحراف از تفرق 3:1 را نشان دادند و مابقی نشانگرها 49 - نشانگر - به 6 گروه لینکاژي به طول 1225/5 cM در LOD= 3 شامل 39 نشانگر پیوسته و 10 نشانگر غیر پیوسته تفکیک شدند. - جدول - 1
