بخشی از مقاله
مقدمه
تــنش خشــکی، بیشــترین تــاثیر را در کــاهش عملکــرد گیاهــان دارد. ایــن تــنش ســبب ایجــاد اثرهاي فیزیولوژیکی و بیوشـیمیایی متعـددي در گیاهــان مــیشــود Tanaka et al., 1990) ؛ Jamaux et al., 1997 ؛ Smimoff et al., 1993 ؛
(Tabaizadeh, 1998
جــو گیــاه متــداول در منــاطق مدیترانــهاي خاورمیانــــه و شــــمال آفریقــــا اســــت کــــه داراي بارنــــــدگی ســــــالانه کمتــــــر از 300
میلــیمتــر هســتند Copper et al., 1987) ؛ .(Acevedo and Ceccarelli, 1989تولیـد در این منطقه به وسیله یخبندان در زمسـتان و اوایـل بهار و به خصوص تنشهاي گرمـا و خشـکی در خلال زمان پر شدن دانه محدود میشود.
ارزیــابی عملکــرد دانــه در منــاطق بــا تــنش فـــراوان، معمـــولتـــرین معیـــار عملـــی بـــراي توصـــیف ســـازگاري ارقـــام بـــراي شـــرایط پـرتنش اسـت Fischer and Maurer, 1978) ؛ Gauzzi et al., 1993 ؛ .(Blum, 1988
آزمایش هاي زیادي در سالها و در مناطق متعدد براي شناسایی مناسبترین ژنوتیپ ها مورد نیاز است . این راهکار نیـاز بـه صـرف زمـان زیـادي داشته و همچنین نیازمند بررسی صفاتی است که تــاثیر مثبتــی بــر عملکــرد و پایــداري آن داشــته باشند. بنابراین شناسائی صفات مؤثر در پایـداري عملکــرد در محــیطهــائی کــه بــا کمبــود آب مواجـــه باشـــند دشـــوار اســـت. صـــفاتی کـــه امکـــان ارزیـــابی وضـــعیت آب گیـــاه و بـــه
خصـــــــــوص محتـــــــــواي نســـــــــبی آب
(Relative Water Content:RWC) بـرگ را فراهم می سازند، اطلاعـات مناسـبی بـراي میـزان کمبود آب در گیاه در یـک زمـان خـاص ارائـه مـــیدهنـــد. توانـــائی صـــفت محتـــواي نســـبی آب بـــرگ بـــراي اصـــلاح در تـــنش خشـــکی توســـــط پلتـــــونن ســـــاينیـــــو و مـــــاکلا
(Peltonen-sainio and Makela, 1995)،
آرنــــــــــــــــــائو و مونویــــــــــــــــــوکس
(Arnau and Monneveux, 1995) و تیولات و همکـاران (Teulat et al., 2003) بـراي جـو گزارش شده است.
بروز تنش رطوبتی در انتهاي فصل رشـد کـه معمولاً توام با افزایش شدید دماي محیط اسـت، بــه ویــژه در منــاطقی کــه وزش بادهــاي گــرم و خشک در مرحله پرشدن دانه نیز مرسـوم اسـت، باعــث چروکیــدگی و در نتیجــه کــاهش وزن دانه ها میشود. طول دوره پرشدن دانه و میـزان و ســرعت انتقــال مــواد ذخیــره شــده بــه دانــههــا و کارایی فتوسنتز جاري بر این صفت مـوثر اسـت
Caldrin et al., 1999) ؛.(Blum, 1996 در دیمزارهــاي نیمــهگرمســیري کشــور، خشــکی و گرمــاي انتهــاي دوره رشــد ســبب کــاهش طــول دوره رشد و اختلال در فتوسنتز و جریـان انتقـال مجدد مواد فتوسنتزي شده و نهایتا باعث کاهش وزن دانه میشود.
روشهـاي بـهنـژادي مولکـولی، تولیـد ارقـام متحمــل بــه خشــکی بــا ظرفیــت نگهــداري آب بیشـــــتر را امکـــــانپـــــذیر کـــــرده اســـــت
2
مکانیابی برخی QLT هاي کنترلکننده تحمل ................
.(Hammam Mohammad, 2004) بسـیاري از مکانهاي ژنـی کنتـرل کننـده صـفات مـرتبط بـا تحمل به خشکی مکانیابی شده اند و ارتباط بین این مکانهاي ژنی و تحمل به خشـکی از طریـق عملکرد نسبی لاینها در شرایط خشک ارزیـابی شده است .(MacKill, 2003)
هندلی و همکـاران (Handly et al., 1994)
طی تحقیقی پی بردند که QTLهـایی در بـازوي بلنــد کرومــوزوم چهــارم جــو، بــازدهی مصــرف آب و ســـازگاري بـــا محـــیطهـــاي خشـــک را کنتــــرل مــــیکننــــد. تیــــولات و همکــــاران
(Teulat et al., 2003, 2001a,b)، 32 ناحیـه ژنــومی کنتــرلکننــده صــفات تنظــیم اســمزي و کربوهیدراتهاي قابـل حـل در آب و محتـواي نسبی آب برگ را در جمعیت حاصـل از تلاقـی Tadmor × Er/Apm شناسایی کردند. التینکو و همکاران ( Altinku et al., 2003) با استفاده از نتــاج F2 حاصــل از تلاقــی دو والــد حســاس و متحمــل بــه خشــکی Tokak × ST5819، بــین یـــک نشـــانگر AFLP و مقاومـــت در مقابـــل علف کش پاراکوات و مقـدار نسـبی آب بـرگ به عنوان معیارهاي تحمل به خشـکی پیوسـتگی، مشاهده کردند.
بـائوم و همکــاران((Baum et al.,1996,2003
در تحقیقی کـه در مرکـز بـین المللـی تحقیقـات کشاورزي در مناطق خشک (ایکاردا) انجام شد، برخی QTLهاي کنترل کننده صـفات وزن هـزار و عملکــرد دانــه جــو را شناســایی کردنــد. ایــن محققین برخی از QTLهـا را اختصاصـی منطقـه
مدیترانه دانستند و برخـی از QTLهـا را عمـومی دانسـته و در زمـره QTLهـاي اصـلی محسـوب
کردند.
Hamman Mohammed (2004) با استفاده از راهبــرد جدیــد شناســایی QTL کــه مبتنــی بــر تلاقی برگشتی پیشرفته با خویشاوند وحشـی جـو
( Hordeum vulgare L ssp spontaneum )
بوده است، براي صفات تنظیم اسمزي، محتـواي نســبی آب بــرگ، تبعــیض ایزوتــوپ کــربن، عملکرد ماده خشک، و عملکرد دانه در شـرایط خشـــک در گلخانـــه، QTLهـــایی را شناســـایی کردند.
شناسایی عوامل ژنتیکی کنترل کننده صـفات مرتبط با تحمل به خشکی که با سهولت بیشـتري قابل تشخیص بوده و تحت تاثیر عوامل محیطـی قرار نمی گیرنـد، زمینـه شناسـایی و ایجـاد ارقـام متحمل به خشکی را از طریق گزینش به کمـک نشــانگرها بــه عنــوان مکمــل روشهــاي مرســوم فــراهم مــیســازد. ارزیــابی صــفات در مرحلــه گیاهچه، سرعت بیشتر نسبت به ارزیابی فنوتیپی، امکان انتخـاب همزمـان صـفات متعـدد بـا یـک نمونه DNA، شناسایی ژنهاي فرعی در حضـور ژنهــاي اصــلی و تشــخیص ژنهــاي مطلــوب و نــامطلوب از دیگــر مزایــاي گــزینش بــه کمــک نشانگرها است.
مکان یابی QTLهابراي صفات عملکرد دانـه، شاخص حساسیت بـه خشـکی((SSI، وزن هـزار دانــه و محتــواي نســبی آب بــرگ و همچنــین برآورد میزان تاثیر هر یـک از QTLهـا و تعیـین
3
” نهال و بذر“ جلد 24، شماره 1 ، سال 1387
نشــانگرهاي مولکــولی پیوســته بــا QTLهــا و پیشنهاد آن ها براي گـزینش بـه کمـک نشـانگر، اهداف اصلی این تحقیق بودند.
مواد و روشها
مــواد گیــاهی و محــل اجــراي آزمــایش:
در ایـــن تحقیـــق، 158 لایـــن دابلـــد هاپلوئیـــد بــه همــراه دو والــد متحمــل بــه خشــکی جــو
Wi2291 و (Ceccarelli et al.,1998) Tadmor
مورد بررسی قرار گرفتند. تهیه لایـن هـاي دابلـد هاپلوئید با روش کشت دانه گـرده نـارس انجـام شــد و تکثیــر آنهــا در گلخانــه توســط محققــین ایکاردا انجام شده بود. دو آزمایش مزرعهاي در ایستگاههاي تحقیقاتی تل هادیا (طول جغرافیایی
Nَْ36 1، عرض جغرافیایی Eَ26ْ37 و ارتفـاع از سطح دریا 300 متـر) و بـردا (طـول جغرافیـایی َ56Nْ35 ، عرض جغرافیـایی Eَ10ْ37 و ارتفـاع از سطح دریـا 354 متـر) واقـع در شـمال کشـور سوریه در سال زراعی2004 انجـام شـد. در ایـن ســال زراعــی میــزان بارنــدگی در تــلهادیــا 422
میلیمتر و در بردا 321 میلیمتر بود.
تمام لاینهاي مورد بررسی به همراه والـدین در قالــب طــرح آلفــا-لاتــیس در دو تکــرار در شرایط مزرعه کاشـته شـدند و صـفات عملکـرد دانه، و وزن هـزار دانـه و شـاخص حساسـیت بـه خشکی ارزیـابی شـدند. بـراي محاسـبه شـاخص حساســـیت بـــه خشـــکی از فرمـــول فیشـــر و مـورر((Fischer and Maurer, 1978 اسـتفاده شد. بدین منظور، به طور قراردادي، ایستگاه تـل
هادیا به عنوان محیط مسـاعد و ایسـتگاه بـردا بـه منزلــه محــیط نامســاعد در نظــر گرفتــه شــد. در آزمــایش دیگــري،لاینهــاي مــذکور و والــدین آن ها در سه تکـرار درون گلـدان در گلخانـهاي که حرارت آن قابل کنترل بود، کاشـته شـدند و محتواي نسبی آب برگ از طریق رابطه تیـولات وهمکاران((Teulat et al., 2001a و به صورت زیر محاسبه شد:
(وزن خشک – وزن تورژسانس))/وزن خشک – وزن تر)RWC=
اسـتخراج DNA :DNA ژنــومی لایــنهــا بــر اســـاس روش ســـقایی- معـــروف و همکـــاران
(Saghai-Maroof et al., 1984) بــا انــدکی تغییر استخراج شد. بخش هوایی 10-20 گیاهچه چهار تا شش هفتهاي براي هر والـد و لایـن هـاي دابلــد هاپلوئیــد بــه صــورت تــازه جمــعآوري و
DNA آنهـــا جداســـازي شـــد. کمیـــت DNA
اســتخراج شــده بــه صــورت مقایســهاــي در ژل آگارز %1 سنجیده شد.
ارزیابی نشانگرهاي مولکولی: تعداد 68 نشـانگر
SSR و103 نشانگر AFLP براي تعیین ژنوتیـپ، روي جمعیت مورد بررسی استفاده شد که نهایتاً با حذف نشـانگرهاي داراي کـج شـکلی تفـرق، نشــانگرهاي انفــرادي غیرپیوســته و گــروههــاي کوچــــک فاقــــد نشــــانگر SSR، تعــــداد 50
نشــــانگر SSR و 93 نشــــانگر AFLP روي نقشـــــه نهـــــایی قـــــرار گرفـــــت. واکـــــنش زنجیــــرهاي پلیمــــراز بــــه روش رامســــی و همکــــاران (Ramsay et al., 2000) در تجزیــــــه SSR و بــــــا روش زابیــــــو و وس
4
Mapmaker 3.0
QTL-Carthographer
ABI Prism1377
مکانیابی برخی QLT هاي کنترلکننده تحمل ................
(Zabeau and Vos, 1993) در تجزیـهAFLP
انجام شد. براي نشانگرهاي SSR، دمـاي اتصـال بر حسب طول آغازگر و مطابق با توصیه شرکت ســازنده و تجــارب آزمایشــگاه بیوتکنولـــوژي ایکاردا در نظر گرفته شد. تجزیـه مولکـول هـاي نشــاندار شــده DNA بــا رنــگهــاي فلورســنت چندگانه به وسیله دستگاه تـوالییـاب اتوماتیـک
انجــام شــد. بعــد از آن کــه
نمونه ها در داخل یک سیستم ژل عمودي تزریق شدند، الکتروفور، آشکار شدن لیـزري و سـپس تجزیــههــاي کــامپیوتري بــر روي بــا اســتفاده از نرم افزارهاي Genescan و Genotyper انجـام و نمرهدهی شدند.
تجزیه و تحلیل دادهها: تجزیه واریـانس بـراي هر یک از صفات در دو آزمـایش مزرعـه اي بـه صــورت جداگانــه انجــام شــد. ضــریب تغییــرات ژنتیکی صفات مزبور نیز محاسبه شد. براي تهیـه نقشــــــــه پیوســــــــتگی از نــــــــرم افــــــــزار
اســـــــــتفاده شـــــــــد
.(Lander et al.,1987) نسـبتهـاي نـوترکیبی
بر اساس معادله کوزامبی (Kosambi, 1944) به فاصله بر حسب واحد سانتیمورگان تبدیل شـد.
گروههاي پیوستگی با حـداکثر میـزان نـوترکیبی معــادل 0/5 و حــداقلLOD معــادل 9 تشــکیل شدند. انتساب گروه ها به کروموزوم ها با استفاده از گــزارشهــاي موجــود در رابطــه بــا مکــان کروموزومی نشانگرهاي SSR و بـا فـرض عـدم وجــود معاوضــه، چــرخش یــا مضــاعف شــدن صورت گرفت.
بــراي تطبیــق نســبتهــاي آللــی موجــود بــا نسبتهاي مندلی مورد انتظار در هر مکـان ژنـی بــراي هــر نشــانگر، آزمــون χ2 انجــام شــد. نقشــه نهایی با حذف نشانگرهایی که جایگـاه واحـدي داشته یا انحراف از تفرق مندلی نشان دادند، تهیه شــد. همچنــین تــک نشــانگرهاي غیرپیوســته و گروه هاي کوچـک فاقـد نشـانگر SSR از نقشـه نهایی حذف شدند.
تجزیــــهQTL بــــه کمــــک نــــرم افــــزار
نســـــــــــــــخه 1/15
(Christopher et al., 2001) انجـام شـد و بـا
اســتفاده از روش مکــانیــابی فاصــلهاي مرکــب مبتنی بر رگرسیون چندگانه مـورد اسـتفاده قـرار گرفت. حداقل LOD براي شناساییQTL برابـر
2/5 و حداکثر فاصله پویش، دو سـانتیمورگـان در نظــر گرفتــه شــد. عــلاوه بــر تعیــین جایگــاه و میزان اثر هر QTL، واریانس فنوتیپی که توسـط هر یک از QTLها و نیز توسط مجموع QTLها در یک مدل رگرسیون چندگانه توجیه میشـد، محاسبه شد.
