بخشی از مقاله
بررسی همبستگی پلی مورفیسم rs7270101 از ژن ITPA با بیماری مالتیپل اسکلروزیز در جمعیت ایران
چکیده
مقدمه: مالتیپل اسکلروزیس(( MS یک بیماری التهابی و خودایمنی است که بر سیستم عصبی مرکزی (CNS) اثر گذاشته و تخریب
میلین و تحلیل آکسونی را به دنبال دارد. بررسیها نشان داده که ژن ITPA در مسیر داروهای ایمونوساپرسیو مانند تیوپورین ها نقش دارد.
هدف: هدف این مطالعه بررسی همبستگی (IVS2+21A>C) rs7270101 SNP در بیماران مالتیپل اسکلروزیز در جمعیت ایران می باشد.
روش: جمع آوری نمونه های خون و سپس استخراج DNA ژنومیک از ًِ فرد نرمال و ًِ فرد بیمار انجام شد. برای تعیین ژنوتیپ پلی مورفیسم rs7270101 از روش miss-match PCR- RLFP و Real Time PCR استفاده شد. نتایج حاصل از آنالیز مولکولی
ژنوتیپ افراد بیمار و کنترل در نرمافزار آماری SPSS آنالیز شد.
نتیجه: هر دو جمعیت بیمار و کنترل در تعادل هاردی واینبرگ برای پلی مورفیسم rs7270101 قرار داشتند. یک اختلاف آماری معنی دار از نظر فراوانی بین اللهای این پلی مورفیسم در دو جمعیت وجود دارد. بنابراین پلی مورفیسم مورد مطالعه از ژن ITPA احتمالا با
روند افراد بیماری مالتیپل اسکلروزیس ارتباط دارد.
کلید واژگان: مالتیپل اسکلروزیس، ITPA، بررسی همبستگی، rs7270101، تیوپورین.
مقدمه
مالتیپل اسکلروزیس((MS یک بیماری التهابی و خودایمنی است که بر سیستم عصبی مرکزی(CNS اثر گذاشته و تخریب میلین و تحلیل آکسونی را به دنبال دارد ( (Compston A, Coles A., 2002شیوع. بیماری معموﻻً در جوانی بوده و بیشتر در زنان رخ می
دهد(.(Debouverie M. et al., 2008
اگرچه تحقیقات جهت شناسایی درمان موثری برای MS ادامه دارد ولی تا کنون درمان قطعی برای این بیماری ارائه نشده است. عمده درمان های رایج کنونی در جهت متوقف ساختن سیر بیماری و یا در جهت کاهش علائم ناتوان کننده بیماری عمل می کنند.
گروهی از این درمان ها، استفاده از داروهای آنالوگ پورین مانند آزاتیوپورین می باشد . این داروها به عنوان سرکوب کننده و تنظیم کننده سیستم ایمنی و عوامل سیتوتوکسیک عمل می کنند. بنابراین برای درمان افرادی با بیماری خود ایمنی مثل مالتیپل اسکلروزیز
استفاده می گردند ( .(Weinshenker, B. G., 2004 اما متأسفانه برای داروهای تیوپورینی اثرات جانبی از جمله توکسیسیتی مغز استخوان و هپاتوتوکسیسیتی را نیز گزارش نموده اند. عقیده بر آن است که احتمال دارد فاکتورهای ژنتیکی مسئول این اثرات جانبی
باشند. در بین آنزیم های دخیل در مسیر متابولیکی تیوپورین ها آنزیم اینوزین تری فسفات پیروفسفوهیدرولاز ( (ITPA است که
اینوزین تری فسفات ( (ITP را به اینوزین مونوفسفات ( (IMP هیرولیز می کند. نقص در فعالیت این آنزیم باعث تجمع ITP در
سلول می شود و در افراد تحت درمان با داروهای تیوپورین سبب تجمع غیرمعمول متابولیت های تیواینوزین (تیو- (ITP می گردد
.(von Ahsen et al., 2008) فعالیت ITPA به صورت ژنتیکی تعیین می گردد به طوری که افراد هتروزیگوت برای پلی مورفیسم در
اینترون ٍ (rs7270101) این ژن فقط حدود ًَ % مقدار طبیعی آن را بیان می کنند .(Atanasova S. et al., 2007)
در نتیجه به نظر می رسد که مطالعه پلی مورفیسم های ژن ITPA در افراد مبتلا به بیماری M.S میتواند راهکاری جدید برای یافتن
اطلاعات در زمینه پاتوژنز و درمان بیماری باشد. از این رو در این مطالعه ما به بررسی فراوانی پلی مورفیسم از ژن ITPA در جمعیتی از بیماران مبتلا به M.S و افراد کنترل ایرانی پرداخته ایم .
مواد و روش ها
نمونهها از افراد مبتلا به مالتیپل اسکلروزیس مراجعه کننده به بیمارستان سینا،در کلینیک تخصصی M.S شهر تهران جمعآوری شد. تشخیص بیماری توسط پزشک متخصص و بر اساس راهنمای تشخیص و بر اساس روش تشخیصی مکدونالد((McDonald صورت گرفت.
DNA ژنومیک از خون گرفته شده از بیماران و افراد نرمال استخراج شد. برای استخراج DNA از کیت )DNG plus سیناژن، ایران) و بر اساس دستورالعمل پیشنهادی شرکت سازنده کیت انجام شد.
برای تعیین ژنوتیپ افراد در محل پلی مورفیسم های rs7270101 از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی برای آنالیز توالی نوکلئوتیدی محل هدف و پرایمرهای مورد نیاز از مقاله Maeda و همکارانش (Kurzawski M. et al., 2009) استفاده شد.
پرایمرها قطعه ًٍُ جفت بازی که حاوی پلیمورفیسم مورد نظر بود را تکثیر می کردند. واکنش تکثیر قطعات DNA به تعداد ًُ
سیکل انجام شد.
واکنش برش محصول PCR پلی مورفیسم مور مطالعه با استفاده از آنزیم (Takara, Japan) MnxI انجام شد. قطعات حاصل از
تکثیر در صورت وجود آلل C در محل SNP با این آنزیم بریده شده و دو قطعه ٌِْ و ٍُ جفت بازی ایجاد می شود (شکل ٌ). محصول برش آنزیمی روی ژل آکریل آمید ٌٍ% الکتروفورز شد و پس از رنگ امیزی با اتیدیوم بروماید نتیجه آن آنالیز شد.
برخی نمونه ها نیز با روش Real Time PCR و یک جفت پرایمر و یک پروب اختصاصی بررسی شدند.
نتایج حاصل از آنالیز مولکولی ژنوتیپ افراد بیمار و کنترل در نرمافزار Excel وارد و برای آنالیزهای آماری از نرمافزار (version16) SPSS استفاده شد.
نتایج و بحث
در این مطالعه از روش PCR-RFLP و Real Time PCR برای تعیین ژنوتیپ پلی مورفیسم rs7270101 از ژن ITPA استفاده شد (شکل ٌ).
شکلٌ- برای تشخیص ژنوتیپ افراد در محل پلی مورفیسم نوکلئوتیدی rs7270101 از تکنیک Mismatch PCR-RFLP و انزیم رستریکشن XmnI استفاده گردید. قطعات حاصل از برش روی ژل پلی آکریل آمید ٌٍ درصد بررسی شد. در صورت وجود الل A قطعه ًٍُ جفت بازی و وجود الل C باعث شکل گیری محل برش آنزیم شده و قطعاتی به طول هایٌِْ و ٍُ جفت باز ایجاد می شود. ژنوتیپ هر فرد در بالای ژل نشان داده شده است.
به منظور تایید صحت عملکرد استراتژی طراحی شده تعدادی از نمونه ها برای تعیین توالی ارسال گردید (شکلٍ).
شکل ٍ- نتایج تعیین توالی یک نمونه هتروزیگوت برای rs7270101 که با ژنوتیپ تعیین شده از طریق روش های Mismatch PCR-RFLP و Real Time PCR مطابقت دارد.
پس از تعیین ژنوتیپ پلی مورفیسمها برای تمامی نمونه ها آنالیزهای لازم برای تعیین فراوانی اللی و ژنوتیپی انجام شد. بررسیها حاکی از تعادل هاردی واینبرگ )(Hardy- Weinberg Equilibrium بودن هر دو گروه بیمار و کنترل بود. فراوانی های گروههای ژنوتیپی
برای پلی مورفیسم rs7270101 در گروه بیمار برابر با AA=85%, AC=15%, CC=0 بود (جدولٌ).
