بخشی از مقاله
-1مقدمه و هدف
ریزRNAها گروهی از RNAهای غیر کد کننده با طول 18-25 نوکلئوتید میباشند که بهعنوان یکی از مهمترین عوامل تنظیمی بیان ژن در سال 1993 در کرم لولهای سینورابدیتیس الگانس1 کشف شدند .[13] ریزRNAها اثر خود را بر بیان ژن از طریق جفت شدن با نواحی مکمل خود که اغلب در ناحیهی 3 UTR مربوط به mRNAی هدف و گاهی در نواحی کدکننده، 5 UTR و حتی پروموتور است اعمال میکنند .[19,12,2] اثر تنظیمی ریزRNAها میتواند در سطوح مختلفی از عملکرد ژنوم شامل رونویسی، پردازش RNA، پایداری RNA و ترجمه صورت گیرد .[5] ریزRNAها حدود 60 همهی ژنهای کد کننده را تنظیم میکنند و دارای نقشهای کلیدی در بسیاری از فرایندهای زیستی شامل تکثیر، تمایز، نمو، ایمنی، کهولت و مرگ سلول هستند و شواهد حاکی از نقش آنها در بیماریهایی همچون سرطان میباشد .[4] ریزRNAها بهطور متعارف در هسته توس RNA pol II به صورت ریزRNAی اولیه - 1pri-miRNA - رونویسی میشوند که حدود صد تا چند هزار نوکلئوتید طول دارد .[17] پردازش اولیهی ریزRNAها در هسته توس ریبونوکلئاز نوع III به نام دروشا2 صورت گرفته و پیشساز ریز - 3pre - miRNA - RNA حاصل که 60-100 نوکلئوتید طول و ساختار ساقه- حلقه دارد، دارای انتهای 5 فسفاته و انتهای 3 هیدروکسیله با 2-3 نوکلئوتید آزاد جفت نشده میباشد. سپس pre-miRNA به سیتوپلاسم فرستاده شده و توس دایسر4 مورد
پردازش نهایی قرار میگیرد و یک RNAی دو رشتهای ایجاد می شود. معمولاً یکی از این رشتهها - miRNA* - تجزیه شده و رشتهی دیگر - miRNA - روی مجموعهی القاکنندهی خاموشی - RISC - 5 بارگذاری میشود [19,16] و ترجمهی mRNAهای هدف را سرکوب می-کند .[8] در برخی موارد دیده شده که ریزRNAها میتوانند نقش فعالکنندهی ترجمهی mRNA را نیز داشته باشند .[18] الگوهای بیان ریزRNAها بهشدت تنظیمشده میباشد و تغییر در بیان آن-ها بر روی فرایندهای مهم زیستی مانند تکثیر، آپوپتوز و تمایز تأثیرگذار است .[3] تغییر بیان ریزRNAهای مرتب با سرطان - انکومیرها - در ایجاد سرطان نقش دارد .[11] پلیمورفیسم در pre-miRNA توانایی اتصال Dicer به آن را تحت تأثیر قرار میدهد و از این طریق بر پردازش و میزان ریزRNAی کارآمد و مؤثر تأثیر گذاشته و میتواند با سرطانها و بسیاری از بیماریها در ارتباط باشد [15]؛ به همین جهت تعیین پلی-مورفیسم در ریزRNAها، با روشهای سریع، دقیق و کمهزینه از اهمیت بالایی برخوردار است. برای بررسی ارتباط پلیمورفیسمها با بیماریها تکنیکهای متعددی وجود دارد. مانند RFLP-PCR، تتراپرایمرآرمز و ARMS-PCR که جهت بررسی پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی - SNP - 6 مورد استفاده قرار میگیرند .[1] هدف از مطالعهی حاضر، طراحی پرایمر و استفاده از تکنیک RFLP-PCR برای بررسی پلیمورفیسم در ریزRNA و تعیین مزایا و معایب این تکنیک میباشد.
-2تئوری و پیشینه:
فراوانی پلیمورفیسم در ریزRNAها در جمعیتهای متفاوت بسیار کم میباشد و برای بررسی آنها در افراد، به تکنیکی دقیق نیاز است که حتی در صورت عدم مشاهدهی آلل مغلوب یک SNP در یک جمعیت، بتوان به نتایج بهدستآمده اطمینان داشت. تکنیک RFLP-PCR - مخفف - Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR یکی از روشهای بررسی جهشهای نفطهای، ریزحذفها و SNPها می-باشد که با استفاده از آنزیمهای محدودکننده انجام میگیرد .[1] آنزیمهای محدودکننده1، آنزیمهایی هستند که جایگاه مشخصی در DNA را شناسایی کرده و برش میدهند. این آنزیمها منشأ باکتریایی داشته و به سه نوع تقسیم میشوند. جایگاه شناسایی در هر سه نوع، چنان اختصاصی است که تفاوت در تنها یک نوکلئوتید مانع شناخته شدن توس آنزیم میگردد. بر این اساس میتوان آللهایی که در یک نوکلئوتید متفاوتند را از طریق برش یا عدم برش در توالی تکثیر یافته از یکدیگر افتراق داد. در صورت وجود توالی قابلشناسایی توس آنزیم محدودکننده، برش انجام گرفته و قطعهی اولیه به دو قطعهی کوچکتر تقسیم میشود. درصورتیکه توالی قابلشناسایی توس آنزیم محدودکننده وجود نداشته باشد، قطعهی اولیه بدون تغییر باقی میماند. پس از هضم آنزیمی توالی تکثیرشده، ارزیابی اندازهی قطعات ایجادشده با تکنیک ژلالکتروفورز امکانپذیر میباشد. ازاینرو به این تکنیک، چندشکلی طولی قطعات محدودشده - RFLP - میگویند .[1]
در این مطالعه، از تکنیک تتراپرایمر جهت بررسی پلی-مورفیسم در ناحیهی حلقهی2 پیشساز mir-27a به عنوان نمونه استفاده شد. همچنین آنزیمی از نوع سوم استفاده شد که قادر است DNA را در جایگاه شناسایی متیله کرده - برخلاف آنزیمهای نوع دوم - و در همان جایگاه شناسایی برش انجام دهد - برخلاف آنزیمهای نوع اول - . miR-27a از تنظیمکنندههای مهم بهویژه در سلولهای ایمنی است .[10,6] همچنین این ریزRNA از ورود HCV و انتروویروس - EV71 - 71 و از تکثیر آنان در سلول جلوگیری میکند [20,7] و ژنهای مربوط به چندتوانی3 را در سلولهای سرطانی جنینی، به طور منفی کنترل میکند .[9] نقش این انکومیر در اکثر سرطانها به اثبات رسیده است rs11671784 .[6]
