بخشی از مقاله
مقدمه:
مقاومت متقاطع به داروهای شیمی درمانی، یکی از مهمترین دلایل عدم موفقیت در درمان سرطان ها به ویژه لوسمی ها ست. در این نوع مقاومت بیمار به طور همزمان به تعداد زیادی از داروهای شیمی درمانی که از نظر ساختار و عملکرد ارتباطی با هم ندارند مقاوم می شود. عوامل متعددی در بروز این پدده نقش دارند که از جمله آن ها می توان به کاهش میزان دارو در داخل سلول، غیر فعال شدن آپوپتوزیس و خنثی شدن دارو در درون سلول اشاره نمود.
در این میان مهمترین دلیل این پدیده را می توان فعال شدن بیش از اندازه گروهی از ژن ها دانست که با دارا بودن خاصیت پمپی موجب خروج دارو از سلول می گردند. این ژن ها که تحت عنوان ABC transporter شناخته می شوند دارای گروه های متعددی هستند که مهمترین آنهاMDR1 وMRP1 است. . ارتباط بین ژن MRP1 و ایجاد مقاومت دارویی در بیماران لوکمی گزارش شده است
.چند فرضیه برای افزایش بیان این ژن وجود دارد از جمله :
-1 یکی از عمده ترین سیستمها خصوصا در سلولهای سرطانی تگثیر ژن میباشد
-2 تغییرات کروموزومی درسلولهای سرطانی -3 وجود ارتباط بین SNP های این ژن و قدرت افزایش بیان ژن.
نویسندگان این مقاله در طی طرح تحقیقاتی111 بیمار مبتلا به لوکمی شامل 42 بیمارAML و 59 بیمارALL را مورد بررسی قرار دادند که تعدادی افزایش بیان ژنMRP1 را نشان دادند و دسته دیگر با وجودشرایط یکسان از نظر دارو و شرایط کلینیکی و پارا کلینیکی افزایشی در بیان ژن MRP1 را نشان ندادند و همچنین تفاوت تغییرات کروموزومی قابل ملا حظه ای هم بین انها دیده نشد - - 1
تکثیر ژنMRP1 با استفاده از 2 روشFISH وReal Time RT-PCRمورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که در هیچ یک از بیماران این مکانیزم وجود ندارد در حالی که در رده سلولی کنترل تکثیر ژن مکانیزم اصلی بود. - - 2
از طرفیSNP های متعددی در ژن MRP گزارش شده است. این SNP ها بر ساختمان و بیان این ژن تاثیر گذارده وفعالیت آن را تغییر می دهند - . - Ref بنابراین SNP ها می توانند عامل تعیین کننده ای در افزایش خطر ایجاد مقاومت در شرایط سرطانی محسوب شود.
هدف این مطالعه بررسی 4 نوع - T2684C, C2007T, C2665T ,C2012T - SNP در اگزونهای 16و20 های ژنMRP1 در مورد 3 گروه که عبارتند از - 1 بیمارانی که افزایش بیان ژن MRP1 داشتند - 2 بیمارانی که افزایش بیان|ژن MRP1 نداشتند و گروه - 3 تعدادی افراد کنترل بوده است.
روش:
برای انجام این تحقیق به ترتیب استخراج DNA، PCR، SSCP، Sequensing، بررسی نتایج Sequensing انجام شد و نتایج ثبت گردید.
پس از استخراج DNA ، تکثیر قطعات مربوط به اگزون های 16 و 20 توسط PCR انجام شد. PCR مربوط به اگزون های 20و16 ژن MRP1 در 30 سیکل و با د مای آنلینگ 52 سانتیگراد گذاشته شد. طول محصول PCR تکثیریافته با پرایمر اگزون 16مورد نظر 247 جفت باز میباشد و طول محصول PCR تکثیریافته با پرایمر اگزون 20 مورد نظر 181 جفت باز میباشد.
یافته ها: DNAاستخراج شده
استخراج DNA ژنومی از نمونههای خون افراد سالم و بیمار صورت گرفت
شکل 16-3 استخراج DNA ژنومی و آنالیز آن بر روی ژل آگاروز
PCRاگزونهای 16 و 20 ژن MRP1
PCR مربوط به اگزونهای 16 و 20 انجام شد و بعد الکتروفورز بر روی ژل آگاروز صورت گرفت و باندهای موردنظر به ترتیب با طولهای 247 و 181 جفتبازی پدیدار شدند.
شکل 17-3 محصول PCR اگزونهای 16 و 20 ژن MRP1
SSCP از اگزونهای 16 و 20 ژن MRP1 بر روی ژل اکریلامید
تکنیک SSCP بر روی نمونههای ALL در بیماران فاز Relapse انجام شد و در کنار آن از نمونه-های نرمال هم به منظور مقایسه استفاده شد. هدف از این کار یافتن نمونههای مشکوک و بعد فرستادن آنها برای تعیین سکانس بود. بعد از فرستادن نمونههای مشکوک برای تعیین سکانس، نتایج حاصل از آن بررسی شدند.
نتایج حاصل از تعیین سکانس با برنامه نرمافزاری Sequencher و Chromas بررسی و blast شدند. بعد از blast نتایج سکانس، هیچ پلی-مورفیسم خاصی در دو اگزون 16 و 20 بیماران ALL در فاز Relapse یافت نشد. در واقع، نمونه-های Relapse که افزایش بیان ژن MRP1 در آنها ثابت شده بود برای تعیین سکانس فرستاده شدند که در نهایت ارتباط خاصی بین افزایش بیان ژن و پلیمورفیسمهای آن یافت نشد.
بحث:
بهطورکلی نتایج نشان داد که میزان بیان ژن در بیماران لوسمی ALL از نوع Relapse نسبت به بیماران CR و افراد نرمال افزایش یافته است. همچنین بعد از بررسی پلیمورفیسمهای این ژن در بیماران Relaps، SNP خاصی در دو اگزون مورد نظر یافت نشد. دلیل انتخاب این دو اگزون وجود 4SNP شناختهشده در آنها بود که نتایج ما در بیماران لوسمی هیچکدام از این SNPها را نشان ندادند.
اساس ژنتیکی مقاومت دارویی بهطورگسترده در شرایط in vivo و in vitro مورد مطالعه قرار گرفته است. نظرات متنوعی در زمینه عامل ایجادکننده و گسترش دهنده مقاومت دارویی در سلولهای سرطانی وجود دارد. فرضیه رایج در این زمینه، فرضیه جهش ژنی– مقاومت دارویی - gene mutation-drug resistance - میباشد.
بر طبق این فرضیه جهش در ژنهای عامل ایجاد مقاومت دارویی موجب ایجاد تغییرات در ساختار رونوشت یا پایدارتر شدن آن شده و در نهایت با فعالتر شدن این پروتیینها فنوتیپ مقاومت پدید میآید. با این حال فرضیه جهش ژنی – مقاومت دارویی قادر به توجیه نرخ بالای پیدایش مقاومت دارویی در سلولهای سرطانی نیست. نرخ پدید آمدن مقاومت دارویی در حدود 10-3 تا 10-6 است. در حالیکه جهش در هر دو آلل ژنهای منابولیزهکننده دارو با نرخی در حدود 10-12 تا 10-14 روی میدهد
سازوکار دوم مطرح دراین زمینه ، آنیوپلوئیدی - Aneuploidy - در سلولهای سرطانی است. حالت آنیوپلوئیدی با کاتالیز کردن بازآراییهایی کروموزومی موجب پدید آمدن مقاومت میگردد 5 - ،6،4،. - 3 برطبق این سازوکار، فنوتیپ مقاومت به دارو در اثر تکامل گام به گام یک واقعه ساده کروموزومی پدید میآید. این واقعه ساده کروموزومی نوعی مقاومت ضعیف در برابر دارو ایجاد میکند. با پیچیدهتر شدن ترکیبات کروموزومی، مقاومتی از نوع بالاتر در سلول پدید می-آید.
