بخشی از مقاله
چکیده
تکنیک تتراپرایمرآرمز-PCR با استفاده از چهار پرایمر در یک ویال PCR برای بررسی پلیمورفیسمهای تکنوکلئوتیدی - SNP - بکار میرود و شامل دو پرایمر خارجی و دو پرایمر داخلی میباشد که هریکاز پرایمرهای داخلی برای تکثیر یکی از حالتهای SNP بکار میرود. در این مطالعه، به عنوان نمونه، از این تکنیک برای بررسی پلیمورفیسم در جایگاه اتصال miR-214 در ژن EGFR، که میتواند بر اتصال این ریزRNA اثر بگذارد، استفاده شد. ابتدا توالی ژن از پایگاه NCBI بدست آمده و سپس پرایمرها بااستفادهاز نرم-افزار Oligo7 طراحی شد. این تکنیک، نسبت به سایر روشهای بررسی پلیمورفیسمها از نظر هزینه و زمان به-صرفهتر است.
-1مقدمه و هدف:
چندشکلیهای تک نوکلئوتیدی1 در ژنوم که در افراد مختلف دارای بازهای متفاوت میباشند را SNP گویند. SNPها شایعترین تنوع ژنتیکی در انسان هستند که میتوانند با بیماریهای متعدد مانند سرطانها، ناباروری و بیماریهای ژنتیکی در ارتباط باشند؛ بهطوری که یک نوکلئوتید خاص باعث افزایش یا کاهش خطر ابتلا به بیماری گردد. به همین جهت تعیین ژنوتیپ افراد در جایگاه SNPها با استفاده از روشهای ساده، سریع، ارزان و دقیق، از اهمیت ویژهای برخوردار است .[1] جهت بررسی پلیمورفیسمهااز تکنیکهای متعددی استفاده میگردد و یکی از ارزانترین آنها تکنیک Tetra primer ARMS -PCR - مخفف Tetra mutation system -PCR - primer amplification refractory میباشد که روشی سریع و ساده برای بررسی جهشهای نقطهای، ریزحذفها و SNPها میباشد .[1] هدف از مطالعهی حاضر، طراحی پرایمر و استفاده از تکنیک تتراپرایمرآرمز بهمنظور بررسی پلیمورفیسم در جایگاه اتصال miR-214 در ژن EGFR و تعیین مزایا و معایب این تکنیک میباشد.
-2تئوری و پیشینه:
تکنیک تتراپرایمرآرمز-PCR، با استفاده از چهار پرایمر - دو پرایمر داخلی و دو پرایمر خارجی - در یک ویال PCR، تغییر تکنوکلئوتیدی را موردبررسی قرار میدهد. پرایمرهای داخلی رفت و برگشت بهگونهای طراحی میشوند که نوکلئوتید انتهای ' 3 حاوی SNP موردنظر باشد. بهطوریکه در پرایمر داخلی رفت با یک شکل SNP و در پرایمر داخلی برگشت با شکل دیگر SNP موردنظر مکمل باشد. همچنین سومین نوکلئوتید از انتهای ' 3 پرایمرها با DNAی الگو جفت نمیباشد. بهاینترتیب، در صورت وجود چندشکلی غالب، پرایمر خارجی رفت با پرایمر داخلی برگشت باند داده و پرایمر داخلی رفت به دلیل عدم جفتشدگی در 3 نوکلئوتید انتهای ' 3 قادر به تکثیر توس DNA پلیمراز نمیباشد. در صورت وجود چندشکلی مغلوب، پرایمر خارجی برگشت با پرایمر داخلی رفت باند میدهد و پرایمر داخلی برگشت در 3 نوکلئوتید انتهایی فاقد جفتشدگی میباشد و تکثیر نمیگردد. پرایمرهای خارجی بهگونهای طراحی میشوند که محصولاتی با طول متفاوت به وجود آورند تا پس از PCR، تکثیر هر دو شکل پلی-مورفیسم، بر اساس تفاوت طول باندها با استفاده از الکتروفورز قابلتشخیص باشد. همچنین پرایمرهای خارجی رفت و برگشت با یکدیگر نیز باند میدهند که این باند در کنترل صحت PCR بکار میرود .[1] در این پژوهش از این تکنیک جهت بررسی پلیمورفیسم rs884225 در ناحیهی 3'UTR از ژن EGFR استفاده شد. ژن EGFR1 که به نامهای 2HER1 و 3ERBB1 نیز شناخته میشود، کد کنندهی رونوشت 5616 نوکلئوتیدی است که پذیرندهی فاکتور رشد اپیدرمی را ایجاد میکند .[23] این پروتئین، اولین تیروزین-کیناز کشف شده و یکی از 90 پروتئین تیروزینکیناز و یکی از 60 پذیرندهی تیروزینکینازی درون سلول است EGFR .[3,13] در اعمال گوناگون سلولی مانند رشد، تکثیر، تمایز، بقا، تحرک سلولی و نمو1 بافت نقش دارد .[21] به علاوه، در نمو اولیه،
شروع رشد مو، نمو پوست و دریچهی هلالی قلب، و در استخوان- سازی اولیهی استخوانهای بلند از غضروف، ضروری است .[11,16,19] پیامرسانی EGFR، ایمنی ذاتی را در زخمهای استریل پوست، استروئیدسازی را در سلولهای لیدیگ2، و کنترل فعالیت حرکتی و تنظیم ریتم شبانهروزی3 را در هیپوتالاموس، و حفظ تعادل جمعیت سلولی را در سلولهای بنیادی و پیشساز عصبی، فعال میکند .[2,8,6,17] همچنین مشاهده شده که مهارکنندههای EGFR سبب باززایی آکسونها در نورونهای مغزی و فیبرهای نوری آسیبدیده میشود EGFR .[7,15] برای ورود برخی ویروسها مانند 4CMV و 5AAV6 و 6HCV و 7HIV به سلول لازم است .[20,22,10,4] EGFR با سرطانها در ارتباط است و جهش و افزایش بیان این انکوژن در سرطانهای ریه، کلون، پانکراس و گلیوبلاستوما به اثبات رسیده است؛ به همین دلیل تعدادی از داروهای شیمی-درمانی جهت مهار این پذیرنده بهکار میروند .[9] ریزRNAها ازمهمترین کنترلکنندههای بیان ژنها هستند که از طریق جفت شدن با نواحی مکمل خود که اغلب در ناحیهی 8 3 UTR مربوط به mRNAی هدف است، در کنترل بیان ژن نقش دارند .[18] پلیمورفیسم در 3'UTR از mRNAی هدف، بر میانکنش آن با ریزRNA تأثیرگذار است و درنتیجه عملکرد آن را دچار اختلال میکند و به همین دلیل این پلیمورفیسمها از اهمیت بالایی برخوردارند .[14] پلیمورفیسم rs884225 که در جایگاه اتصال miR-214 قرار دارد و میتواند بر اتصال این ریزRNA اثر بگذارد در این مطالعه به عنوان نمونه مورد بررسی قرار گرفت .[5]
-3مواد و روش ها:
ابتدا توالی ژن EGFR از پایگاه اطلاعاتی NCBI دریافت شد و سپس پرایمرها طراحی شدند. جهت بررسی rs884225 در ناحیهی
