بخشی از مقاله
مقاله بررسی ژن کاندید پیروفسفاتاز آرابیدوپسیس با استفاده از روش تیلینگ
چکیده
روش(Targeting local lesion in genome) TILLING روش ژنتیک معکوس قدرتمندي است که در آن از آنالیز هترودوپلکس براي شناسایی جهشهاي نقطهاي موجود در ژن(هاي) مورد نظر استفاده میشود. در سالهاي اخیر این روش به دلیل امکان غربالگري سریع سريهاي آللی جهش یافتهاي که بدون نیاز به تراریختی در جمعیتهایی که در آنها جهش زایی با مواد جهشزا ایجاد شدهازروش،کاربرد گستردهاي یافته است. در این تحقیق نیز تیلینگ براي مطالعه عملکرد ژن کاندید پلاستیدیل پیروفسفاتاز در آرابیدوپسیس استفاده شد. 24 لاین تیلینگ داراي جهشهاي نقطهاي متفاوت در این ژن مورد بررسی ويقرار گرفت و تغییر الگ متابولیکی هر یک از لاینها مطالعه شد. نتایج بدست آمده از تجزیه و تحلیل متابولیتهاي لاینهاي بررسی شده نقش پیروفسفاتازي کاندیداین ژن را مورد تایید قرار داد.
کلمات کلیدي: آرابیدوپسیس، تیلینگ، ژنتیک معکوس
مقدمه
روش ژنتیک معکوس در سالهاي اخیر براي گذر از دادههاي توالییابی به فنوتیپ حاصله و در نتیجه تلاش براي درك عملکردیک ژن در گونههاي مورد نظر کاربرد گستردهاي داشته است. بسیاري از روشهایی که در حال حاضر استفاده میشود RNAi)، حذف ژن،جهش زایی هدفدار، ردیابی ترانسپوزون) بر پایه ایجاد تراریختی است که کاربرد آن در بسیاري از گونههاي گیاهیعملییاحیوانی نیست. در این میان روش ژنتیک معکوس تیلینگ روشی است بدون نیاز به ایجاد تراریختی و در تمامی گیاهان یا حیواناتی که میتوان در آنها جهش زایی انجام داد، صرف نظر ازسیستم جفتگیري، گرده افشانی، سطح پلوئیدي و یا اندازه ژنوم کاربرد دارد. این روش اولین بار توسط مک کالوم و همکاران (2000) از طریق ادغام کردن گیاهان جهش یافته با همدیگر، ایجاد هترودوپلکس میان DNA ادغام شده، تکثیر ناحیه مورد نظر و استفاده از (Denaturinghighperformanceliquidchromatography, dHPLC) براي شناسایی محل جهش از طریق تفاوت کروماتوگرافی انجام شد. پس از آن بهینه سازيهاي مختلفی به منظور کاهش هزینه و انجام سریعتر آن، با استفاده از نوکلئاز CELI و سیستم آنالیز ژل LI-COR صورت گرفته است. در این روش میتوان از طریق جهش زایی، سريهاي آللی از جهشهاي خاموش، بد معنی و بیمعنی ایجاد نمود و تاثیر هر یک از این نوع جهشها را در ژن مورد نظر مورد مطالعه قرار داد. اگر چه روش تیلینگ در ابتدا به منظور شناسایی جهشهاي القا شده در آرابیدوپسیس مورد استفاده قرار گرفت، اما در حال حاضر این روش براي استفاده در گونههاي گیاهی زیادي بهینه سازي شده است. این روش علاوه بر کاربرد براي شناسایی ژن، در تحقیقات دیگري از جمله ارزیابی چندشکلی DNA، ژنومیک کارکرد و اصلاح نباتات مورد استفاده قرار گرفته است و در سالهاي اخیر کاربرد روزافزونی داشته است. در تحقیق حاضر نیز از این روش به دلیل عدم نیاز به تراریختی و امکان بررسی سريهاي آللی مختلف ژن بدون نیاز به خاموشی ژن، براي مطالعه عملکرد ژن کاندید پلاستیدیل پیروفسفاتاز در آرابیدوپسیس استفاده شد.
موادو روشها براي مطالعات تیلینگ، 24 لاین جهش یافته در ژن مورد نظر از شرکت بریکون آلمان دریافت شد. به منظور بررسی خصوصیات لاینهاي تیلینگ، بذور دریافتی از هر یک از لاینها براي کاشت مورد استفاده قرار گرفت. به منظور غربالگري جمعیت تیلینگ و همچنین بررسی نوع زیگوسیتی لاینهاي مورد مطالعه پس از توالییابی آنها طی نسلهاي متفاوت، با استفاده از نرم افزار الیگو دو جفت آغازگر براي ژن پلاستیدیل پیروفسفاتاز طراحی شد به گونهاي که این آغازگرها بتوانند تمام طول ژن را پوشش دهند.
جداسازي DNA ژنومی با استفاده ازکیت استخراج DNA با نام DNA Mag Attract 96 (Qiagen) بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده انجام گرفت. براي تعیین نوع زیگوسیتی (هموزیگوت، هتروزیگوت و نوع وحشی) در گیاهان مورد مطالعه، نرم افزار Seqman از سري نرم افزارهاي Lasergene مورد استفاده قرار گرفت. براي تجزیه و تحلیل ترکیبات متابولیکی در گیاهان آرابیدوپسیس مورد بررسی، نمونهبرداري از گیاهان 15 روز پس از کاشت انجام شد و عصاره گیاهی آماده سازي شد. الگوي متابولیتی نمونههابا استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازيAgilent) Agilent7890، Santa Clara، CA،(USAمتصل به طیف سنج جرمی
LECO)PegasusHT، St.Joseph، تعیین گردید. انجام فنوتیپینگ به منظور تعیین سطح برگ و رشد برگ گیاهانبرايتیلینگ مقایسه تفاوت رشد این گیاهان نسبت به گیاهان شاهد با استفاده از دستگاه GROWSCREEN(JPPC) مورد استفاده قرار گرفت. تخمین سطح برگ (LA) با استفاده از نرم افزار Bayer2Area شدوMaskEdit محاسبه . به منظور تجزیه واریانس تغییرات الگوي متابولیکی در هر یک از لاینها، از نرم افزار SAS و رویه GLM استفاده شد. از آنجا که نمونههاي مورد استفاده براي هر لاین با توجه به نوع زیگوسیتی از تعداد یکسانی برخوردار نبود لذا طرح آماري کاملا تصادفی نامتعادل در نظر گرفته شد. مقایسات میانگیننیز با آزمون LSD و در سطح آماري پنج درصد صورت گرفت.
