مقاله بررسی ژن کاندید پیروفسفاتاز آرابیدوپسیس با استفاده از روش تیلینگ

word قابل ویرایش
4 صفحه
دسته : اطلاعیه ها
12700 تومان
127,000 ریال – خرید و دانلود

مقاله بررسی ژن کاندید پیروفسفاتاز آرابیدوپسیس با استفاده از روش تیلینگ

چکیده
روش(Targeting local lesion in genome) TILLING روش ژنتیک معکوس قدرتمندی است که در آن از آنالیز هترودوپلکس برای شناسایی جهشهای نقطهای موجود در ژن(های) مورد نظر استفاده میشود. در سالهای اخیر این روش به دلیل امکان غربالگری سریع سریهای آللی جهش یافتهای که بدون نیاز به تراریختی در جمعیتهایی که در آنها جهش زایی با مواد جهشزا ایجاد شدهازروش،کاربرد گستردهای یافته است. در این تحقیق نیز تیلینگ برای مطالعه عملکرد ژن کاندید پلاستیدیل پیروفسفاتاز در آرابیدوپسیس استفاده شد. ۲۴ لاین تیلینگ دارای جهشهای نقطهای متفاوت در این ژن مورد بررسی ویقرار گرفت و تغییر الگ متابولیکی هر یک از لاینها مطالعه شد. نتایج بدست آمده از تجزیه و تحلیل متابولیتهای لاینهای بررسی شده نقش پیروفسفاتازی کاندیداین ژن را مورد تایید قرار داد.

کلمات کلیدی: آرابیدوپسیس، تیلینگ، ژنتیک معکوس

مقدمه

روش ژنتیک معکوس در سالهای اخیر برای گذر از دادههای توالییابی به فنوتیپ حاصله و در نتیجه تلاش برای درک عملکردیک ژن در گونههای مورد نظر کاربرد گستردهای داشته است. بسیاری از روشهایی که در حال حاضر استفاده میشود RNAi)، حذف ژن،جهش زایی هدفدار، ردیابی ترانسپوزون) بر پایه ایجاد تراریختی است که کاربرد آن در بسیاری از گونههای گیاهیعملییاحیوانی نیست. در این میان روش ژنتیک معکوس تیلینگ روشی است بدون نیاز به ایجاد تراریختی و در تمامی گیاهان یا حیواناتی که میتوان در آنها جهش زایی انجام داد، صرف نظر ازسیستم جفتگیری، گرده افشانی، سطح پلوئیدی و یا اندازه ژنوم کاربرد دارد. این روش اولین بار توسط مک کالوم و همکاران (۲۰۰۰) از طریق ادغام کردن گیاهان جهش یافته با همدیگر، ایجاد هترودوپلکس میان DNA ادغام شده، تکثیر ناحیه مورد نظر و استفاده از (Denaturinghighperformanceliquidchromatography, dHPLC) برای شناسایی محل جهش از طریق تفاوت کروماتوگرافی انجام شد. پس از آن بهینه سازیهای مختلفی به منظور کاهش هزینه و انجام سریعتر آن، با استفاده از نوکلئاز CELI و سیستم آنالیز ژل LI-COR صورت گرفته است. در این روش میتوان از طریق جهش زایی، سریهای آللی از جهشهای خاموش، بد معنی و بیمعنی ایجاد نمود و تاثیر هر یک از این نوع جهشها را در ژن مورد نظر مورد مطالعه قرار داد. اگر چه روش تیلینگ در ابتدا به منظور شناسایی جهشهای القا شده در آرابیدوپسیس مورد استفاده قرار گرفت، اما در حال حاضر این روش برای استفاده در گونههای گیاهی زیادی بهینه سازی شده است. این روش علاوه بر کاربرد برای شناسایی ژن، در تحقیقات دیگری از جمله ارزیابی چندشکلی DNA، ژنومیک کارکرد و اصلاح نباتات مورد استفاده قرار گرفته است و در سالهای اخیر کاربرد روزافزونی داشته است. در تحقیق حاضر نیز از این روش به دلیل عدم نیاز به تراریختی و امکان بررسی سریهای آللی مختلف ژن بدون نیاز به خاموشی ژن، برای مطالعه عملکرد ژن کاندید پلاستیدیل پیروفسفاتاز در آرابیدوپسیس استفاده شد.

موادو روشها برای مطالعات تیلینگ، ۲۴ لاین جهش یافته در ژن مورد نظر از شرکت بریکون آلمان دریافت شد. به منظور بررسی خصوصیات لاینهای تیلینگ، بذور دریافتی از هر یک از لاینها برای کاشت مورد استفاده قرار گرفت. به منظور غربالگری جمعیت تیلینگ و همچنین بررسی نوع زیگوسیتی لاینهای مورد مطالعه پس از توالییابی آنها طی نسلهای متفاوت، با استفاده از نرم افزار الیگو دو جفت آغازگر برای ژن پلاستیدیل پیروفسفاتاز طراحی شد به گونهای که این آغازگرها بتوانند تمام طول ژن را پوشش دهند.
جداسازی DNA ژنومی با استفاده ازکیت استخراج DNA با نام DNA Mag Attract 96 (Qiagen) بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده انجام گرفت. برای تعیین نوع زیگوسیتی (هموزیگوت، هتروزیگوت و نوع وحشی) در گیاهان مورد مطالعه، نرم افزار Seqman از سری نرم افزارهای Lasergene مورد استفاده قرار گرفت. برای تجزیه و تحلیل ترکیبات متابولیکی در گیاهان آرابیدوپسیس مورد بررسی، نمونهبرداری از گیاهان ۱۵ روز پس از کاشت انجام شد و عصاره گیاهی آماده سازی شد. الگوی متابولیتی نمونههابا استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازیAgilent) Agilent7890، Santa Clara، CA،(USAمتصل به طیف سنج جرمی
LECO)PegasusHT، St.Joseph، تعیین گردید. انجام فنوتیپینگ به منظور تعیین سطح برگ و رشد برگ گیاهانبرایتیلینگ مقایسه تفاوت رشد این گیاهان نسبت به گیاهان شاهد با استفاده از دستگاه GROWSCREEN(JPPC) مورد استفاده قرار گرفت. تخمین سطح برگ (LA) با استفاده از نرم افزار Bayer2Area شدوMaskEdit محاسبه . به منظور تجزیه واریانس تغییرات الگوی متابولیکی در هر یک از لاینها، از نرم افزار SAS و رویه GLM استفاده شد. از آنجا که نمونههای مورد استفاده برای هر لاین با توجه به نوع زیگوسیتی از تعداد یکسانی برخوردار نبود لذا طرح آماری کاملا تصادفی نامتعادل در نظر گرفته شد. مقایسات میانگیننیز با آزمون LSD و در سطح آماری پنج درصد صورت گرفت.

این فقط قسمتی از متن مقاله است . جهت دریافت کل متن مقاله ، لطفا آن را خریداری نمایید
word قابل ویرایش - قیمت 12700 تومان در 4 صفحه
127,000 ریال – خرید و دانلود
سایر مقالات موجود در این موضوع
دیدگاه خود را مطرح فرمایید . وظیفه ماست که به سوالات شما پاسخ دهیم

پاسخ دیدگاه شما ایمیل خواهد شد