بخشی از مقاله
کاربرد تیلینگ در ژنومیکس کارکردی
چکیده
پیشرفتهای اخیر در پروژههای توالی یابی ژنوم در مقیاس انبوه، کاربرد تکنیکهای جهش سنتی را نه تنها در استراتژی ژنتیک مستقیم بلکه ژنتیک معکوس امکان پذیر ساخته است. تیلینگ (هدف قرار دادن ضایعات موضعی القا شده) یک دهه پیش به عنوان جایگزینی برای جهش-های درون جایگیر (insertional mutations) ابداع گردید. مهمترین مزیت تیلینگ به عنوان یک استراتژی ژنتیک معکوس این است که می-توان آن را در هر گونه گیاهی صرف نظر از اندازه ژنوم، سطح پلوئیدی یا روش تکثیر به کار برد. همچنین راهی برای بررسی یک ژن هدف در هر گیاهی بدون داشتن دانش اولیه درباره محصول ژن میباشد که در ژنومیکس کارکردی از اهمیت بالایی برخوردار است. پروتکل تیلینگ فراوانی بالایی از جهشهای نقطهای را ایجاد میکند که به طور تصادفی در ژنوم توزیع شدهاند. پتانسیل بالای جهشزایی مواد شیمیایی برای ایجاد نرخ بالای جایگزینی نوکلئوتیدی به وسیله تراکم بالای جهشهای گزارش شده برای جمعیتهای تیلینگ در گونههای مختلف گیاهی به اثبات رسیده است. پیشرفتهای اخیر در تیلینگ مرهون ابزارهای بیوانفورماتیک، روشهای جدید شناسایی جهش از جمله اندونوکلئازهای حساس و خاص نوکلئوتیدهای جفت ناجور )mismatch) و کشف جایگزینهای متنوع برای غربالگری LI-COR و پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (Single Nocleotide Polymorphism) با استفاده از فنآوریهای نسل جدید توالییابی (Next Generation Sequencing) میباشد. استراتژی تیلینگ کاربردهای فراوانی در ژنومیکس کارکردی دارد. علاوه بر این، در مطالعات پایه و کاربردی با ایجاد تغییراتی در روش تیلینگ اصلی، روشهایی از قبیل اکوتیلینگ (Ecotilling) یا تیلینگ حذفی (Deletion Tilling) ابداع و مورد استفاده قرار گرفته است.
کلمات کلیدی: تیلینگ، ژنومیکس کارکردی، جهش.
.1 مقدمه
یکی از مستقیمترین راههای تعیین کارکرد ژن، شناسایی یک جهش در ژن خاص و ارتباط این جهش به تغییر فنوتیپی در ارگانیسم جهش-یافته است. دو روش اصلی ژنتیک مستقیم و معکوس برای تعیین کارکرد ژن و ارتباط بین ژنوتیپ و فنوتیپ به طور وسیعی استفاده شدهاند. در روش ژنتیک مستقیم (از فنوتیپ به ژنوتیپ) جمعیت بزرگی از جهش یافتهها ایجاد و برای تغییرات در صفت یا فرآیند بیولوژیکی مورد نظر غربال میشوند. توالی ژن مسئول فنوتیپ تغییر یافته میتواند از طریق فرایند کلونینگ مبتنی بر نقشه جداسازی شود. این روش علیرغم وقتگیر بودن، در گونههای با ژنوم بزرگ مانند گندم به طور موفقیت آمیزی برای کلونیگ چندین ژن استفاده شده است 5)، 31، .(21 در ژنتیک معکوس (از ژنوتیپ به فنوتیپ)، توالی ژن مشخص است و جهشیافتهها با توجه به تغییرات ساختمانی در ژن مورد نظر شناسایی و
1
غربال میشوند .(2) این روش به طور کلی به زمان کمتری نسبت به ژنتیک مستقیم نیاز دارد و به طور مؤثری در بسیاری از گونههای گیاهی استفاده شده است. در ژنتیک معکوس تکنولوژیهای متعددی مانند جهشزایی درون جایگیر (insertional) با T-DNA، علامتگذاری ترانسپوزون/ رتروترنسپوزون و یا خاموش کردن ژن با استفاده از تداخل RNA ارائه شده است 20)، 17، 27، 24،.(10 با این حال، بسیاری از این روشها فقط برای گیاهان مدل با ژنوم کوچک، مانند آرابیدوپسیس و برنج به طور کامل قابل اجرا هستند و حتی در این گونهها، برخی موانع وجود دارند که استفاده از آنها را محدود میسازند .(25) تیلینگ (هدف قرار دادن ضایعات موضعی القا شده) یک دهه قبل به عنوان جایگزینی برای جهشزایی درون جایگیر در آرابیدوپسیس ایجاد شد .(12) استراتژی تیلینگ ابتدا به عنوان یک خط مشی برای ژنومیکس کارکردی ایجاد شد اما به زودی به یک ابزار ارزشمند در اصلاح نباتات به عنوان جایگزینی برای روش تراریخته تبدیل شد .(25) اجرای تیلینگ در حال حاضر برای تعداد زیادی از محصولات مهم از جمله برنج، جو، گندم، ذرت، سورگوم، سویا، کلزا و گوجه فرنگی گزارش شده است 6)، 7، 8، 13، 1، 3، 4، 19، 14، .(29
.2 مزایای تیلینگ نسبت به سایر روش های ژنتیک معکوس
آن چه روش تیلینگ را از روش تراریخته متمایز میسازد شناسایی جهشهای متعدد در یک ناحیه هدف از ژنوم میباشد. این روش علاوه بر بهره بردن از فراوانی بالای جهشهای القایی توسط جهشزایی سنتی، از تکنیک های حساسی جهت شناسایی جهش تک نوکلئوتیدی استفاده میکند. مزیت اصلی تیلینگ به عنوان یک استراتژی ژنتیک معکوس این است که میتوان آن را در هر گونه گیاهی صرف نظر از اندازه ژنوم، سطح پلوئیدی یا روش تکثیر به کار برد. همچنین راهی برای بررسی یک ژن هدف در هر گیاهی بدون داشتن دانش اولیه محصول ژن می - باشد که در ژنومیکس کارکردی از اهمیت بالایی برخوردار است.
مواد جهشزا، فراوانی بالایی از جهشهای نقطهای را ایجاد میکنند که به طور تصادفی در ژنوم توزیع شدهاند .(25) با استفاده از تیلینگ در آرابیدوپسیس جهت رسیدن به جهشزایی اشباع در مقایسه با جهشزایی T-DNA جمعیت بسیار کوچکتر مورد نیاز است 20)، .(23 استفاده از تیلینگ، تجزیه و تحلیل کارکردی ژنوم های بزرگ که از طریق جهشزایی درون جایگیر دشوار میباشند را امکان پذیر میسازد.
یکی دیگر از مزایای بزرگ تکنولوژی تیلینگ توانایی مواد جهشزا در ایجاد طیفی از جهشها، از جمله تغییرات missense، کوتاه سازی و جهش در توالی اتصال1 میباشد. علاوه بر آلل هایی با فقدان عملکرد، مواد جهشزای شیمیایی آللهایی با افزایش و یا کاهش عملکرد ایجاد میکنند که میتوانند طیف وسیعی از فنوتیپها را ایجاد کنند .(21) در تیلینگ بر خلاف دیگر روشهای ژنتیک معکوس از قبیل خاموشی RNAi و ترانسپوزون، جهشها پایدار هستند. علاوه بر این، فنآوری RNAi، جهشزایی درون جایگیر از طریق T-DNA و یا علامتگذاری ترانسپوزون متکی بر انتقال ژن میباشد، ولی تیلینگ به انتقال ژن نیاز ندارد و در نتیجه، تنها استراتژی قابل استفاده در ژنتیک معکوس برای گونههایی است که قابل ترانسفورماسیون نمیباشند. تیلینگ به عنوان فنآوری غیر GMO2 معرفی میشود.
2
.3 طرح کلی تکنیک تیلینگ
اولین گام در اجرای تکنیک تیلینگ ایجاد جمعیت جهشیافته و سپس تشخیص جهشها در توالی هدف می باشد. برای تشخیص جهش از روشهای مختلف شامل توالییابی مستقیم، LI-COR، کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا )DHPLC3(، الکتروفورز، کاپیلاری الکتروفورز، ذوب شدگی با تفکیک بالا (HRM)، طیف سنجی جرمی MALDI-TOF و توالی یابی نسل جدید )NGS( استفاده می شود. اولین شرط استفاده از روش تیلینگ ایجاد یک جمعیت القایی با استفاده از جهشزاهای فیزیکی/شیمیایی میباشد. بذرهای تیمار شده با مواد جهشزا کشت و گیاهان M1 برداشت میشوند کهمتعاقباً برای بدست آوردن جمعیت M2 خودبارور میشوند. DNA استخراج شده از گیاهان M2 در غربالگری جهش استفاده میشوند. برای خودداری از تکرار جهشهای یکسان فقط یک گیاه M2 از هر M1 برای استخراج DNA استفاده میشود. بذرهای M3 ایجاد شده از خودباروری نتاج M2 میتوانند برای مدت طولانی ذخیره شوند. اتیل متان سولفونات (EMS) به طور وسیعی به عنوان یک مواد جهشزای شیمیایی در مطالعات تیلینگ برای ایجاد جمعیت جهشیافته در گیاهان استفاده شده است. EMS از طریق آلکیله کردن G سبب جهش متقاطع (Transition) و به جای جفت شدن با C با T جفت می شود. پرایمرهای PCR برای دامنه هدف کارکردی طراحی میشوند. در مرحله بعدی DNA از جمعیت استخراج و پس از یکسان کردن غلظت، DNA همه نمونهها با هم مخلوط و تشکیل یک خزانه میدهند. برنامه تحت وب (http://www.proweb.org) CODDLE به وسیله قرار دادن توالیهای ژنومی، cDNA یا پروتئین به محققان اجازه میدهد تا کارکرد احتمالی ژن را در جمعیت جهشیافته ارزیابی کنند. به طور کلی برای موجودات دیپلوئید یک خزانه DNA متشکل از 8 نمونه میتواند در تشخیص جهش مفید باشد. بنابراین بسته به سطح پلوئیدی، هتروزیگوسیتی و افزایش SNP بهترین خزانه برای گونه مورد مطالعه باید مشخص شود. همان گونه که ذکر شد جهت تشخیص جهش القایی از روشهای مختلفی میتوان استفاده کرد که در ذیل روش LI-COR شرح داده میشود. خزانه DNA روی یک پلیت 96 چاهکی آرایه بندی میشوند. پرایمرهای رفت و برگشت هدف از انتهای 5' به ترتیب با IRD 700 و IRD 800 برای تشخیص فلورسنت در 700 و 800 نانومتر برچسبگذاری میشوند. در مرحله بعد، هترودوبلکس و همودوبلکسها از محصولات PCR خزانه متشکل از فرمهای وحشی و جهشیافته به وسیله گرم کردن (دناتوه) و سرد کردن (اتصال) ایجاد و هترودوپلکس ها توسط آنزیم اندونوکلئاز CEL 1 در لوپ mismatch برش داده میشوند. بعد از دوره انکوباسیون، قطعات هضم شده روی یک ژل پلی اکریل آمید دناتوره شده متصل به یک سیستم آنالیز LI-COR 4300 DNA تشخیص داده میشوند. خزانههای دارای جهش القایی شامل مخلوطی از همو و هترودوپلکس میباشند. بنابراین یک محصول با طول کامل (آشکار شده در هر دو کانال 700 و (800 و دو قطعه شکسته شده قابل اندازه گیری (یکی برچسبگذاری شده با IRD 700 و دیگری با (IRD 800 تولید میشوند. مجموع طول قطعات باید مساوی با طول کامل محصول PCR باشد. موقعیت تخمینی جهش توسط توالییابی تائید میشود.
اولین استراتژی که برای روش تیلینگ شرح داده شد شامل تیمار دانههای آرابیدوپسیس با EMS، استخراج و ادغام DNA، واکنش PCR قطعه مورد نظر، تشکیل هترودوبلکس و شناسایی هترودوبلکسها با استفاده از DHPLC بود .(12) از آن زمان، تیلینگ در بسیاری از موجودات مختلف استفاده شد و تغییرات بسیاری در این روش به منظور غربالگری خودکار جهش و کاهش هزینه انجام شد. با گذشت زمان، برای تشخیص جهش، روش هضم هترودوبلکسها با استفاده از اندونوکلئازهای خاص، الکتروفورز پلی اکریل آمید و مشاهده در سیستم ژل بسیار حساس L1-COR، جایگزین روش DHPLC شد که ارزانتر و سریعتر از DHPLC است 9)، .(33 در این روش اندونوکلئاز خاص تک رشته (CEL I) برای شکافتن DNA هترودوبلکس در مکان mismatch استفاده شده است .(30) یک روش دیگر برای تجزیه و تحلیل جهش بدون استفاده از غربالگری LI-COR که در آن آغازگر نشاندار و گران مورد نیاز است، استفاده از ژل پلی اکریل آمید دناتوره کننده با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید میباشد، که تقریبا حساسیت مشابه LI-COR را دارا میباشد .(11)
3
.4 پلت فرمهای تیلینگ و سرویسها
یک جمعیت جهشیافته زمانی یک پلت فرم تیلینگ محسوب میشود که نمونه DNA و دانه جمع آوری شده از یک جمعیت بزرگ M2، آرشیو و وارد پایگاههای داده شود. معمولا پلت فرمهای 5000-3000 تایی از افراد M2 ایجاد میشوند، اگرچه جمعیتهای بزرگتر 10000) گیاه) نیز گزارش شده است .23) )تقریباً تمام جمعیت تیلینگ با استفاده از مواد شیمیایی جهشزا ایجاد شدند که در میان آنها اغلب از عامل آلکیله کننده (EMS) استفاده شده است. به منظور تسهیل جمعآوری سیستماتیک اطلاعات، از جمله دادههای مولکولی و فنوتیپی پلت فرم ایجاد شده، پایگاههای داده تیلینگ ایجاد میشوند و اغلب در دسترس عموم قرار میگیرند .(25) بسیاری از پایگاه های داده موجود حاوی اطلاعات 5000 تا 13000 گیاه M2 هستند. نگهداری اطلاعات فنوتیپی گیاه، اطلاعات در مورد در دسترس بودن DNA استخراج شده از هر بوته و در دسترس بودن دانه در بانک بذر در چنین پایگاه دادهای و همچنین جمع آوری سیستماتیک اطلاعات در مورد پژوهشهای مولکولی و ژنتیک در حال اجرا، ضروری میباشد. مطلوب است که چنین پایگاه دادهای در اینترنت در دسترس عموم باشد. با این حال، ایجاد یک پلت فرم تیلینگ بزرگ وقتگیر، کاربر و هزینهبر میباشد. چندین مرکز تحقیقاتی در اروپا و امریکا شمالی سرویسهای عمومی تیلینگ را برای گونه های گیاهی مختلف Medicago truncatula، L. japonicas، Pisum sativum، Brassica rapa، Solanum
lycopersicum،Oryza sativa ،S. lycopersicum ، A. thaliana، Zea mays، Glycine max، Avena sativa، B. oleracea، Hordeum vulgare ایجاد کردهاند .(25)
