بخشی از مقاله
چکیده
فسفر یکی از عناصر مهم و ضروري براي گیاهان محسوب میشود که در رشد، انتقال انرژي، بیوسنتز ماکرومولکولها، فتوسنتز، تنفس سلولی و به طور کلی سوخت و ساز سلولی نقش اساسی دارد. بهرهگیري و استفاده مؤثر از فسفات آلی نیازمند فعالیت مجموعهاي از آنزیمها موسوم به اسیدفسفاتازها میباشد که هیدرولیز مونواسترهاي فسفات را در محدوده pH اسیدي کاتالیز میکنند.
AtPAP26 یکی از آنزیمهاي مهم در بازیابی فسفات از ترکیبات داخل و خارج سلولی است. در این پژوهش، گیاهان جهش یافته AtPAP26 هموزیگوت آرابیدوپسیس مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که تخریب ژن AtPAP26 موجب افزایش بیان ژنهاي AtPAP17 و AtPAP8 و نیز AtPLP9 شد که پیآمد آن افزایش 1/5 تا 2 برابري در فعالیت فسفاتازي با سوبستراهاي PEP و PLP در مقایسه با گیاهان طبیعی شد.
جالب توجه این که تغییرات معنیدار در فعالیت سایر اسیدفسفاتازها بیانگر وجود شبکهاي ارتباطی براي هماهنگی جهت حفظ هموستازي فسفات در بین آنها است. پیامد چنین تغییراتی افزایش محتواي فسفات کل و آزاد در گیاهان جهش یافته نسبت به گیاهان طبیعی بود که افزایش توده زیستی را به دنبال داشت. چنین نتایجی می تواند نویدبخش راهکاري مناسب در جهت کاهش آلودگیهاي ناشی از مصرف بیرویه کودهاي فسفاته باشد.
مقدمه
فسفر مهمترین عنصر پس از نیتروژن براي رشد گیاهان محسوب میشود که مقدار30 تا 80 درصد فسفر خاك به صورت آلی است و پس از تبدیل به شکل معدنی میتواند به میزان زیاد و قابلتوجهی به عنوان فسفر غذایی گیاهان به مصرف برسد. بهرهگیري و استفاده مؤثر از فسفات آلی نیازمند فعالیت مجموعهاي از آنزیمها موسوم به اسید فسفاتازها میباشد. اسیدفسفاتازها آنزیمهایی هستند که هیدرولیز مونواسترهاي فسفات را در محدوده pH چهار تا هفت کاتالیز میکنند
گروه بزرگی از اسیدفسفاتازهاي درون سلولی و ترشحی موسوم به اسیدفسفاتازهاي بنفش1 بوده که داراي جایگاه دو هستهاي فعال اتصال به فلز میباشند. گیاه آرابیدوپسیس تالیانا داراي 29 نوع از این اسیدفسفاتاز است که در این بین AtPAP26 داراي نقش مهمی در فعالیتهاي فسفاتازي درون سلولی با عملکرد درون سلولی و خارج سلولی می باشد. مطالعات در این زمینه نقش مهم این آنزیم را در بازیابی و انتقال فسفات از طریق هیدرولیز طیف گسترده اي از سوبستراها در گیاهان آرابیدوپسیس در تنش کمبود فسفات نشان داده اند
استفاده از جهشیافتههاي ژنهاي اسیدفسفاتاز میتواند به طور موثري به روشن شدن نقش آنها و نیز اثبات وجود ارتباطات عملکردي و نحوه این ارتباط کمک کند. یکی از روشهاي مستقیم براي بررسی و دسترسی به عملکرد یک ژن، مشخص نمودن تغییرات فنوتیپی مرتبط با جهشهاي ژنی نقص در عملکرد است. در این مطالعه تأثیر جهش در ژن AtPAP26 در گیاهان آرابیدوپسیس تالیانا در مقایسه با گیاهان طبیعی بر میزان فعالیت فسفاتازي، جذب فسفات، محتواي فسفات آزاد درون سلولی و کل نیز بیوماس مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
مواد و روشها
کشت گیاهان آرابیدوپسیس تالیانا
در این مطالعه گیاه آرابیدوپسیس تالیانا واریته کلمبیا - Col-0 - مورد استفاده قرار گرفت. با جستجو در پایگاه اطلاعاتی TAIR و بررسی لاینهاي داراي T-DNA در ژن AtPAP26 لاین - SALK_152821 - انتخاب و بذرهاي آن از SALK Institute Genomic Analysis Laboratory دریافت شد.
بذرهاي گیاه آرابیدوپسس تالیانا پس از ضدعفونی، بر روي محیط کشت جامد MS واجد 1/2 میلیمولار - KH2PO4 - منتقل شدند. 7 روز پس از جوانه زنی گیاهچه ها به محیط هاي واجد 1/2 میلی مولار فسفات - +P - و نیز فاقد فسفات - -P - به مدت 14 روز انتقال یافتند. جهت شناسایی لاینهاي هموزیگوس جهشیافته از روش PCR و بکارگیري همزمان از سه آغازگر، یکی مربوط به مرز چپ - LBb1 - T-DNA و یک جفت آغازگر اختصاصی ژن uniqF - AtPAP26 و - APase5R استفاده گردید.
به منظور بررسی الگوي بیان ژن مورد مطالعه، RNA کل از بافت گیاهان تحت تیمار فسفات با استفاده از کیت RNXTM - -plus - شرکت سیناژن استخراج گردید.
به منظور سنجش فعالیت آنزیمی، پروتئین کل از بافت گیاهان طبیعی، جهشیافته و تراریخت به روش ناصري و همکاران - 2003 - با تغییرات جزئی استخراج شد. در این مطالعه سوبستراهایی از گروههاي مختلف و با توجه به اهمیت عملکردي آنها انتخاب شدند که شامل پارانیتروفنیل فسفات یا pNPP - یک سوبستراي عمومی و آلی - ، فسفوانول پیروات یا PEP - سوبستراي انولیک-فسفات - و فسفاتیدیل کولین یا PLP - سوبستراي فسفولیپید-فسفات - بود.
سنجش فعالیت آنزیمی بر اساس اندازهگیري فسفات آزاد شده توسط معرف آمونیم مولیبدات - هینونن و لاهتی - 1981 و 5 میلی مولار از هریک از سوبستراهاي فوق الذکر صورت گرفت و منحنی کالیبراسیون بر مبناي جذب در OD355 محاسبه گردید. در این آزمایش مقدار فسفر آزاد شده بر حسب واحد آنزیمی گزارش گردید و هر واحد آنزیمی یک میکرومول فسفر آزاد شده در دقیقه تعریف شد. تعیین غلظت پروتئین به روش برادفورد انجام پذیرفت.
جهت اندازهگیري فسفات آزاد درون سلولی و کل در گیاهان از روش ایمز - 1966 - استفاده شد. براي تعیین مقدار فسفات آزاد درون سلولی از معرف آمونیوم مولیبدات استفاده شد و سپس قرائت جذب نمونهها در طول موج 820 نانومتر صورت گرفت. براي تعیین مقدار فسفات کل نیز از محلول نیترات منیزیم و حرارت مستقیم شعله استفاده گردید.
بررسیهاي آماري ابتدا با آزمون نرمال بودن دادهها و یکنواختی واریانسها انجام و تجزیه بر اساس فاکتورلی با طرح کاملاً تصادفی و حداقل دو تکرار انجام گرفت. بررسیهاي آماري از جمله محاسبه میانگینها، خطاي استاندارد مربوط به هر میانگین با استفاده از نرمافزار SPSS V16 انجام پذیرفت. از آزمون دانکن جهت مقایسه میانگینها در سطح احتمال 5 درصد استفاده شد.
نتایج
شناسایی جهشیافتههاي هموزیگوت داراي T-DNA در ژن AtPAP26 گیاه آرابیدوپسیس تالیانا جهت ارزیابی سهم AtPAP26 در میزان فعالیت آنزیمی اسیدفسفاتازي و نیز اثر آن در ایجاد فنوتیپ گیاه آرابیدوپسیس در شرایط وجود و فقدان فسفات، گیاهان جهشیافته هموزیگوت داراي T-DNA در ژن مذکور با استفاده از سه آغازگر APase5R، uniqF و LBb1 شناسایی و مورد بررسی قرار گرفت.
جهت تعیین محل و نحوه درج T-DNA در ژنوم آرابیدوپسیس، قطعه حاصل از تکثیر آغازگرهاي APase5R و LBb1 از ژل آگارز خالصسازي و توالی آن تعیین شد. همردیفی توالی حاصل با توالی ژن AtPAP26 نشان داد که T-DNA در جایگاه اینترون هفتم از ژن AtPAP26 - جایگاه - At5g34850 این گیاهان درج شده است
شکل :1 نمایشی از محل درج T-DNA در جهشیافتههاي ژنAtPAP26 در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا و تعداد اگزون و اینترون موجود در این ژن.
محتواي فسفات کل و آزاد درون سلولی در گیاهان طبیعی و جهشیافته
گیاهان جهشیافته داراي - TD26 - T-DNA یا شیمیایی - pup3 - ژن AtPAP26 داراي بیشترین مقدار از نظر محتواي فسفات کل و آزاد در محیط واجد فسفات بودند و بین این گیاهان تفاوت معنیداري مشاهده نشد. این گیاهان به ترتیب افزایش 86 و 110 درصدي در محتواي فسفات کل و 93 و 110 درصدي در محتواي فسفر آزاد نسبت به گیاهان طبیعی نشان دادند
شکل :2 تغییر محتواي فسفات در گیاهان طبیعی و جهشیافته آرابیدوپسیس تالیانا رشد یافته در شرایط محیطی واجد و فاقد فسفات. - A محتواي فسفات کل، - B محتواي فسفات آزاد یا .Pi دادهها میانگین دو تکرار زیستی از مجموع 10 تا 15 گیاه در هر تکرار میباشد. اختلافات معنیدار در بین میانگینها - P<0.05 - توسط حروف مختلف نشان داده شده است.
تغییر در فعالیت فسفاتازي گیاهان طبیعی و جهش یافته
بررسی فعالیت فسفاتازي کل پروتئین استخراجی از گیاهان - و نه آنزیم تخلیص شده مورد نظر - این امکان را فراهم میکند که تأثیر بیان یا عدم بیان یک ژن در زمینه ژنومی مشابه گیاه در کنار سایر آنزیمهاي درگیر در تأمین فسفات، بهتر مورد بررسی قرار گیرد. آنچه به عنوان فعالیت فسفاتازي اندازهگیريشد، مسلماً نمیتواند تنها اختصاص به آنزیم AtPAP26 داشته باشد و برآیندي از مجموعه تغییراتی خواهد بود که به دلیل بیان یا عدم بیان این ژن در گیاه ایجاد میشود.
گیاهان جهش یافته TD26 کاهش 25-65 درصدي و جهش یافتههاي شیمیایی 20-45 درصدي در میزان فعالیت فسفاتازي با سوبستراهاي مختلف در مقایسه با گیاهان طبیعی نشان دادند - شکل . - 3 کاهش فعالیت آنزیمی گیاهان جهش یافته ژن AtPAP26 در مقایسه با گیاهان طبیعی تنها با سوبستراي pNPP و نه سایر سوبستراهاي مورد مطالعه مشاهده شد.
