بخشی از مقاله
چکیده:
استریتوکیناز نوعی فعال کننده پلاسمینوژن غیر پروتئازي است که به عنوان داروي فیبرینولایتیک در درمان سکته قلبی استفاده میگردد. این پروتئین داراي ساختار تک زنجیره بوده و به صورت طبیعی از استرپتوکوك گروه C تهیه می شود. هدف از این تحقیق تولید استرپتوکیناز نوترکیب واجد دم اتصالی و خالصسازي آن به دو روش کروماتوگرافی افینیته میباشد. بدین منظور ژن کد کننده استرپتوکیناز از سویه استرپتوکوك - Equisimillis - H46A جدا و در وکتور PGEX-4T-2 کلون و آنگاه به سویه بیانی BL21 - DG3 - PlysS ترانسفرم گردید.
سپس با کمک IPTG القاء انجام و پروتئین فیوژن استرینوکیناز- گلوتاتیون S ترانسفراز بیان گردید. دو نوع ستون کروماتوگرافی بر پایه گلوتاتیون و آنتیاسترپتوکیناز طراحی و استرتیوکیناز با هر دو روش جداسازي گردید. نتایج حاصله حاکی از بیان قابل توجه استرپتوکیناز و امکان خالصسازي تک مرحلهاي بر روي هر یک از ستونها میباشد. خلوص استرپتوکیناز با روش SDS-PAGE اثبات و میزان فعالیت آن نیز به کمک سوبستراي کروموژنیک تعیین گردید.
مقدمه:
استرپتوکنیاز - - SK پروتئینی باکتریایی است که باعث لیز شدن لخته خون میگردد . - 1 - اهمیت SK بدلیل توانائیاش در فعال نمودن بلاسمینوژن خون به آنزیم پلاسمین میباشد. پلاسمین قادر است که لخته فیبرینی را از ناحیه اتصال گروه لایزینی شناسائی و تخریب نماید 3 - و. - 2 این خاصیت SK آنرا به یکی از مهمترین داروهاي مورد استفاده در درمان سکته قلبی تبدیل نموده است. تولید SK نوترکیب و نیز طبیعی و خالصسازي آن با روشهاي مختلف کروماتوگرافی براساس تفاوت در حلالیت، بار الکتریکی، اندازه و شکل ملکولی و میان کنشهاي فیزیکی غیر اختصاصی با سطوح توسط محققین مختلف مطالعه شدهاند - 5و. - 4 میان کنشهاي اختصاصی تمایلی - افینیتی - از مناسبترین روشهاي کروماتوگرافی جهت تخلیص پروتئین با درجه خلوص بالا میباشد.
یکی از روشهاي تخلیص SK به روش افینیتی، استفاده از پلاسمین به عنوان لیگاند است . - 6 - ما در پژوهشی روش کروماتوگرافی افینیته حفاظت شده اي طراحی و SK را تخلیص نمودیم . - 7 - در تحقیقی دیگر ژن SK را در بلاسمید حاوي ژن گلوتاتیون S ترانسفراز - - GST کلون نموده وساختار بلاسمیدي با قابلیت بیان پروتئین فیوژن را طراحی کردیم . - 8 - در این مقاله نتایج حاصل از بیان SK فیوژن - - GST- SK و خالصسازي آن با طراحی ستونهاي کروماتوگرافی افینیتی برپایه گلوتاتیون و نیز کروماتوگرافی ایمونوافینیتی برپایه آنتیبادي ضد SK ارائه میگردد.
مواد و روشها
کلون نمودن و بیان SK نوترکیب
ژنSK براساس روش ارائه شده در مقاله قبلی ما - 8 - از باکتري S equisimillis- H46A استخراج و در وکتور PGEX-4T-2 حاوي ژن GST کلون گردید. ساختار پلاسمیدي جدید به سویههاي DH5α و BL21 - DE3 - plysS ترانسفر گردید. در چند لوله آزمایش یک کلونی از باکتري بیانی حاوي ژن SK را در 5ml محیط کشت LB در دماي37º C و 250 RPM کشت داده و پس از افزایش کدورت آن در 600nm به 0/6، با IPTG القاء و در فواصل زمانی 2 ساعت هر یک از لولهها را سانتریفیوژ و رسوب باکتریایی سونیکه گردید. محلول سونیکه را سانتریفیوژ نموده و وضعیت بیان SK در زمانهاي مختلف بر روي ژل SDS-PAGE بررسی گردید. اثبات بیان SK با روش وسترن بلات صورت پذیرفت.
ساخت ستون گلوتاتیون - سفارز و تخلیص SK
به 1/5 گرم سیانوژن بروماید- سفارز 4B آبدهی شده، مقدار 75 mg گلوتاتیون محلول در بافر اتصال دهنده افزوده، پس از 2 ساعت به آن بافر بلاك کننده اضافه کرده و پس از مدتی ژل حاصل به ستون مناسبی انتقال داده شده و 3 دور بطور متناوب با بافر اتصال دهنده و بافر استات - - pH , 4 و نهاتاًیبا بافر گلاسین - - pH , 2/5 شستشو گردید. مقدار 15 ml از کشت BL21 - DE3 - plysS حاوي وکتور نوترکیب را پس از عمل سونیکه از این ستون عبور داده و پس از شستشو با بافر PBS عمل الیوشن توسط بافر تریس حاوي 0/01 درصد گلوتاتیون انجام پذیرفت. پروتئین خارج شده را دیالیز و تغلیظ نموده و جهت جدا نمودن GST-SK فیوژن از یکدیگر، به آن مقدار 0/3mg ترومبین افزوده و پس از انکوباسیون چند ساعته از ستون فوق مجدداً عبور داده شد.
ساخت ستون آنتی– SK سفارز و تخلیص SK
ابتدا خرگوش را در مدت زمان 2 ماه با تناوب 3 هفتهاي و هر بار توسط 25 mg از SK خالص ایمن نموده، پس از خونگیري، سرم حاوي آنتیSK را از ستون SK سفارز 4B که دراین آزمایشگاه طراحی نمودیم عبور داده و پس از شستشو با PBS و الیوشن IgG با بافر گلایسین - - pH ,2/5 عمل دیالیز انجام و آنتی SK خالص تهیه گردید. مقدار 20mg از آنتی SK خالص را به 100 mg رزین Protein A- Sepharose 6MB افزوده و پس از 2 ساعت با PBS و سپس بافر بورات - - pH, 8/6 شستشو داده شد.
مقدار 15/5 mg لینکر DMP جهت استحکام اتصال آنتی- SK به رزین افزوده شد. آنگاه گروههاي آمینی اضافی با بافرگلایسین مسدود گردید. جهت تخلیص SK نوترکیب، مقدار 10 ml از محصول سونیکه یک کشت 6 ساعته را به رزین متصل به آنتی SK افزوده و پس از 2 ساعت به ستون مناسب کروماتوگرافی منتقل گردید. ابتدا شستشو با بافر TBS و بعد عمل الیوشن با محلول 50 mM سدیم فسفات - PH , 12 - صورت پذیرفت و دیالیز گردید. خلوص SK توسط SPS-PAGE احراز و میزان فعالیت آن تعیین گردید.
نتایج و بحث
روند افزایش بیان GST- SK در BL21 - DG3 - physS در ساعت مختلف بررسی گردید. وزن ملکولی پروتئین فیوژن GST- SK حدود 70/5 KD میباشد - SK = 47/5 و - GST=23 که مارکر پروتئینی در ژل SPS- PAGE آنرا تایید میکند - شکل . - 1 از طرفی جهت اثبات دلالت باند داراي افزایش بیان به GST-SK، عمل وسترن بلات از سونیکههاي قبل از القاء و بعد از القاء با کمک آنتیSK انجام پذیرفت که باند مربوطه تایید گردید - شکل . - 2 تخلیص بر روي ستون گلوتاتیون سفارز حاکی از اتصال پروتئین فیوژن GST- SK به لیگاند گلوتاتیون در مرحله اول و آنگاه جدا شدن پروتئینهاي SK و GST از یکدیگر پس از افزودن ترومبین و عبور مجدد از ستون که نهاتاًی SK خالص بدست آمد.
- شکل . - 3 تخلیص به روش ایمونوافینیتی بر روي ستون Sepharose 6 MB- protein A که براساس اتصال نواحی اپیتوپی SK به آنتیبادي عمل میکند انجام پذیرفت و پروتئین فیوژن جدا گردید - شکل . - 4 لذا در این روش نیازي به تولید پروتئین فیوژن داراي دم اتصال و آنگاه برش دادن آن با آنزیم ترومبین نمیباشد. استفاده از رزین سفارز 6MB متصل به پروتئین A از موارد قابل توجه در این روش میباشد، زیرا آنتیبادي تمایل اتصال به پروتئین A از ناحیه FC دارد و لذا نواحی Fab جهت اتصال به آنتیژن - SK - املاًکآزاد میمانند. استفاده از لینکر DMP باعث محکم شدن اتصال آنتیبادي به پروتئین A گردید و لذا از کنده شدن آنتی بادي توسط بافر الیوشن ممانعت نمود و در نتیجه طول عمر ستون جهت خالصسازيهاي متعدد به میزان زیادي افزایش یافت.
