بخشی از مقاله
تخلیص پراکسیداز سویا و بررسی ویژگیهای آن
چکیده: تخلیص پارهای به روش سیستم دوفازی آبی برای پراکسیداز بهدست آمده از پوسته دانه سویا بهینهسازی شد.
تغییر در ترکیب فاز و غلظت سدیم کلرید باعث کاهش قابل قبول در حجم و تفکیک انتخابی آنزیم اسـتخراج شـده گردید. آنزیم به وسیله سامانهی پلی اتیلن گلیکـول / آمـونیم سـولفات / سـدیم کلریـد و
پــس از آن بــه وســیله ســتون ســفادکس ۰۰۲-G تــا ۱۳ مرتبــه تخلــیص شــد. وزن مولکــولی آنــزیم بــه وســیله روش الکتروفورز بر روی ﮊل سدیم دودسیل سولفات پلـی آکریـل آمیـد حـدود ۶۳ کیلـو دالتـون تخمـینزده شـد. آنـزیم تا دمای ۵۸ درجه سانتیگراد پایدار اسـت و فعالیـت بهینـه خـود را در دمـای ۵۶ درجـه سـانتیگراد نـشان داد. آنـزیم در گسترهی pH از ۳ تا ۹ پایدار است و pH بهینه آن در ۶ است. با استفاده از هیدروﮊن پراکسید به عنوان سوبـسترا، مقدارهای Km و Vmax به ترتیب ۳۲/۰میلی مولار و ۲۳/۰
dA/min)، جذب در ۰۱۵ نانومتر) است.
واﮊههای کلیدی: پراکسیداز سویا، تخلیص، استخراج دوفازی آبی، ﮊل صافی، پلی اتیلن گلیکول، سفادکس .G-200
KEY WORdS: Soybean peroxidase, Purification, Aqueous two-phase extraction, Gel filtration,
Polyethylene glycol, Sephadex G-200.
مقدمه
آنزیم پراکسیداز
پراکسیدازها اکسیدوردکتازهایی هستند که هیدروﮊن پراکـسید یا هیدروپراکسیدهای آلـی را بـه عنـوان اکـسیدان مـورد اسـتفاده قرار میدهنـد. ایـن آنـزیم، جهـت کاربردهـای تجـاری فراوانـی استخراج میشوند، که اصلی ترین آنها مصرف آن به عنوان یک مــاده اصــلی و مهــم در تــشخیص مــواد شــیمیایی در تجربیــات آزمایشگاهی است ]۱،۲.[ از این آنزیمها همچنین بهطور گستردهای به عنوان شاخصی از تصفیه استفاده میشود ]۵ ـ۳.[
به علت فعالیت کاتالیتیکی بالای آنها، برخـی از کاربردهـای جدید پیشنهاد شده برای پراکسیدازها شـامل تـصفیه پـسابهـای حاوی ترکیبهای فنولی، سنتز مواد شیمیایی آروماتیـک و زدودن پراکسیـد از موادی چـون نمونههای غذایی، نوشابههـا و ضایعـات
صنعتی است. در واقع پراکسیدازها اکسیدوردکتازهایی هـستند کـه به طور موثری اکسایش ترکیبهـای فنـولی را تـسریع مـیکننـد ]۲ ، ۳،۶.[
برخـی از ترکیـبهـای فنـولی بـسیار مقـاوم زیـستی هـستند، در نتیجه فرایندهای بیولوﮊیکی معمول نمیتواند به صورت مناسـب این ترکیبها را بزداید. بنابراین، توسعه فرایندهای تصفیه مـوثرتری برای زدودن این آلاینـدههـای فنـولی از خطـوط جریـان ضـایعات صنعتی و محیط زیست مورد نیاز است. از میـان روشهـای تـصفیه جدید، نشان داده شده است که فرایند آنزیمی با استفاده از پراکسیداز و هیــدروﮊن پراکــسید در زدودن انــواع آلاینــدههــای فنــولی از محلولهای آبی با راندمان و انتخابپذیری بالا بسیار مـوثر هـستند. اگر چه پژوهشهای فراوانی انجام شـده اسـت تـا تـاثیر پراکـسیداز
بر زدایش کاتالیتیکی آلایندههای فنولی از مخلوط آبـی سـنتز شـده یا از فاضلابهای واقعی را بیان کند، انجـام ایـن فراینـد در بخـش صنعتی هم چنان به علت قیمت بالای اولیه که مربـوط بـه تولیـد و تخلیص آنزیم است مختل میشود. پراکسیدازهای گیاهی نسبت بـه پراکسیداز قـارچی حاصـل از coprinus، رانـدمان بـالاتری از خـود در حذف فنول از پسابهای فنولی نشان میدهند ]۷.[
پراکسیدازها در بافت بسیاری از گیاهان به ویژه در حفرههای دیواره آنها یافت میشوند. بررسی پراکسیدازهای موجود در گیاهان به علت کاربردهای با ارزش و توانمند آن مورد توجه قرار گرفته است. اطلاعات جدیدی درباره پراکسیدازهای گیاهی، پایهای برای بررسی دقیق آنها و ارزیابی کاربردهای دیگر آنهاست. اگرچه پراکسیدازها بهصورت گستردهای در قلمرو گیاهان وجود دارند، درحال حاضر منبع اصلی تجاری در دسترس پراکسیداز ریشه ترب کوهی (HRP) است. به هر حال، دیگر گونههای کشاورزی نیز میتوانند پراکسیدازی با ویژگیهای سوبسترا، راندمان و امکان اقتصادی مشابه و یا بهتر تامین کنند ولی قیمت بالاتر محصول و تخلیص از منابع خام استفاده از آنزیمهای متنوع را در بسیاری از کاربردهای صنعتی محدود میکند ]۶ ـ ۲.[
در سالهای اخیر، پراکسیداز استخراج شده از پوسته دانه سویا، یک فراوردهی با ارزش جانبی صنایع غذایی، توصیف شـده اسـت. پایداری دمایی بالای آن حتـی در pH هـای پـایین و فعالیـت آن در محلولهای غیر آلی، استفاده از آن را برای سنتز مواد شیمیایی آلی و کاربردهای متفاوت صنعتی ممکن میسازد ]۱.[
روشهای تخلیص
جهت تخلیص آنـزیم پـراکسیداز، بـهطـور معمـول پس از همگن کردن ماده خام با محلول تامپون یا آب، محلول همگن شده صاف میشود، با روش رسوب دهی تغلیظ میشود، سانتریفوﮊ میشود و آنزیم به کمک مرحلههای کروماتوگرافی متفاوت، با توجه به مورد استفاده آن، تخلیص میگردد ]۱.[ روشهای گوناگونی از جمله راسبسازی با آمونیم سولفات، کروماتوگرافی تعویض یون، کروماتوگرافی ﮊل صاف کردن و کروماتوگرافی بر اساس میل ترکیبی برای تخلیص پراکسیداز در سامانههای گوناگون به کار گرفته شده است ]۲.[ همچنین امکانات دیگری بـر پایهی تقسیمبنـدی در سامانههـای دو فازی آبی نیـز گزارش شده است ]۹.[ در واقع جهت تخلیص پراکسیداز باید از توالی چندین روش ذکر شده قبلی استفاده کرد.
هدف در بررسی حاضر تهیه محلول پراکسیداز مناسب جهت تصفیه پسابهای فنولی است. از آنجایی که پراکسیداز مورد نیاز جهت تصفیه پسابهای فنولی نیاز به درجه خلوص بالایی ندارد ]۷[، بررسی حاضر سعی بر بررسی منبع ارزان قیمت و مناسب سویا و هم چنین به کارگیری روش تخلیص اولیه استخراج دوفازی آبی و بهینه سازی آن دارد.
استخراج دو فازی آبی
تقسیم شدن در یک سـامانهی دو فـازی آبـی (ATPS) یـک روش انتخابی برای تخلیص بیوملکولهاست. گرایش دو پلیمر آبی متفاوت (پلی اتیلن گلیکول و دکستران) یا یک پلیمر و یک نمـک لیوتروپیک به تقسیم به دو فاز مجـزا در یـک محلـول معمـول از اواخر قرن گذشته مورد توجه قرار گرفته است ]۹.[
این روش گاهی اوقات به عنوان روش توانمند تخلیص اولیـه برای کاهش توده جریان فرایند استفاده میشود. مرحلههای اولیـه تخلیص معمول مانند رسوبدهی آمونیم سولفات، دشوار و وقتگیر است. ATPS فواید بسیاری شامل زمان فـراورش کوتـاه، مـصرف انرﮊی پایین و محیط سازگار با بیومولکول با توجه به وجود مقـدار آب فراوان در سامانههای استخراج را به دنبال دارد ]۶.[
کروماتوگرافی ﮊل صاف کردن
یک روش کروماتوگرافی است که در آن اجزا بـر اسـاس انـدازه تقسیم میشوند که بـه طـور گـستردهای بـرای تخلـیص و آنـالیز مولکولهای بزرگ یا مـاکرومولکولهـای پیچیـده سـنتز شـده و بیولوﮊیکی مانند پروتئینها، پلی سـاکاریدها، نوکلئیـک اسـیدها، و پلیمرهای صنعتی استفاده میشود. جهت تخلیص آنزیم پراکسیداز به طور عمـومی از محـیط ﮊلـی سـفادکس جـی (Sephadex G) به عنوان فاز ایستا استفاده میشـود کـه نـامی تجـاری بـرای ﮊل دکستران cross-linked شده است ]۰۱.[
بخش تجربی
مواد
پوسـتههـای سـویا جهـت اسـتخراج آنـزیم پراکـسیداز از آنهـا از کارخانــه مکــسوی تهیــه شــدند. پلــی اتــیلن گلیکــول PEG)، وزن مولکـــولی ۰۰۰۶)، آمونیـــوم ســـولفات، ســـدیم کلریـــد و Sephadex G –200 مواد عمده مورد استفاده در این بررسی هـستند که همگی از محصولات شرکت مرک خریداری شدند. کلیه این مواد
دارای درجه آزمایشگاهی بوده و بـدون خـالص سـازی بیـشتر مـورد استفاده قرار گرفتند.
استخراج آنزیم پراکسیداز از پوستههای لوبیای سویا
مقدار ٢٥ گرم پوسته سویا در ٢٠٠ میلی لیتر تـامپون فـسفات (٦ pH =، ۴HPO۲/Na۴PO۲NaH، M ۱/۰) بــه مــدت ٢٤ ســاعت در دمای œC ٤ خیسانده شـد. پس از این مـدت مخـلوط با استــفاده از کرباس چهار لایه صاف شـده بـه منظـور شـفاف سـازی محلـول حاصل از صافی عمل سانتریفوﮊ به مدت ١٥ دقیقه بـا دور x g ۰۰۵۳ در همان دما صورت گرفت. محلول رویی حاصل در یخچال با دمای œC٤ نگهداری شده و به عنوان محلول آنزیمی خام استفاده شد ]٩.[
تعیین فعالیت و غلظت کل پروتئین پراکسیداز
فعالیت پراکسیداز در محلول آنزیمی در دمای ۵۲ درجه سانتیگراد با استفاده از ۴‐آمینو آنتی پیرین و هیدروﮊن پراکسید به عنوان سوبسترا اندازه گیری شد. ۱ میلی لیتر محلول آنزیمی تا مقدار مناسبی به وسیلهی تامپون رقیق شد. مخلوط سنجش شامل ۴/۰ میلی لیتر محلول آنزیمی رقیق شده، ۵/۱ میلی لیتر فنول ۰۵ میلی مولار، ۵۷/۰ میلی لیتر ۴ـ آمینو آنتی پیرین، ۵/۱ میلی لیتر هیدروﮊن پراکسید ۱ میلی مولار و ۵۸/۱ میلی لیتر تامپون بود. حجم مخلوط برابر ۶ میلی لیتر بود. غلظت فعال پراکسیداز سویا متناسب با سرعت پیشرفت رنگ در ۰۱۵ نانومتر در محدوده زمانی است که غلظت سوبسترا به صورت قابل توجهی تغییر نکند (۲ دقیقه). در نتیجه پیشرفت رنگ بر حسب زمان در ۰۱۵ نانومتر به وسیلهی دستگاه طیف سنجی مدل Spectronic خوانده شد. سرعت پیشرفت رنگ در این زمان با استفاده از ضریب انهدام ۱cm‐۱M‐ ۸۵/۶ به فعالیت تبدیل میشود. یک واحد از فعالیت آنزیمی به عنوان مقداری از آنزیم که ۱ میکرومول از هیدروﮊن پراکسید را در هر دقیقه در دمای ۵۲ درجه سانتیگراد و pH ۴/۷ تبدیل میکند تعریف میشود. میزان پروتئین با استفاده از روش لوری با استفاده از سرم آلبومین به عنوان استاندارد تعیین میشود ]۲۱.[
تخلیص پراکسیداز
استخراج آبی دو فازی
ATPS با مخلوط کردن مقدارهای مورد نیاز از پلی اتیلن گلیکول، آمونیوم سولفات و NaCl در ۰۸ میلی لیتر آنـزیم اسـتخراج شـده،
با تنظیم حجم کل سامانه به ۰۰۱ میلـی لیتـر تهیـه شـد. پـس از اختلاط کامل سیستم به کناری گذاشته شد تا به دو فـاز مجـزا در قیف جداسازی ۰۰۱ میلی لیتری تقسیم شود. ضریب تقسیم آنزیم (m) از معادلــه m = (Ct/Cb) بــه دســت مــیآیــد کــه Ct و Cb به ترتیب غلظتهای در تعادل آنزیم در فاز بـالا و پـایین هـستند. فاز سبک تر غنی از PEG است در حالی که فاز سنگینتر غنـی از نمک است. محلولی با کاهش حجم فاز پایین، ضریب جداسازی و درصد بازیافت قابل قبول آنزیم از میان نمونههای مـورد آزمـایش انتخاب شد ]۶ و ۹.[ فاز پایینی غنی از نمـک در برابـر آب مقطـر دیالیز شد تا نمک زدوده شود و سپس تا ۴ میلی لیتر با آنتی دیالیز در مقابل محلول PEG با درصدی بـالاتر از درصـد PEG موجـود در محلول انتخاب شده تغلیظ شود ]۹.[
ﮊل صاف کردن در ستون سفادکس G-200
۳ میلی لیتر از نمونه آنزیم تغلیظ شده در مرحله پیش وارد ستون سفادکس ۰۰۲-G شد. ستون (۰۴×۷/۲ سانتیمتر) بـهوسـیلهی بـافر سدیم فسفات mM ۰۱ با نرخ جریان ml/h ۲۱ متعادل و شسته شد. فراکسیونهای سه میلی لیتـری حاصـل از شـست و شـوی سـتون جمع آوری شد. جذب در ۰۸۲ نـانومتر کـه مـشخص کننـده وجـود پروتئین درون محلول است تعیین شد ]۶.[
بررسی پایداری آنزیم
برای تعیین pH بهینه برای پایداری آنـزیم، مقـداری از آنـزیم مورد نظر با نسبت برابر از تامپونهای با pH های متفاوت صورت جداگانـه مخلـوط شـدند و بـه مـدت ۵۱ سـاعت در دمـای اتـاق قـرار داده شـدند. فعالیـت آنـزیم بـا اسـتفاده از روش ذکـر شـده اندازهگیری شد. تاثیر دما بر روی آنزیم با اسـتفاده از انـدازهگیـری فعالیت باقیمانده آنزیم پس از قرار دادن مقداری از آنزیم به مدت ۵۴ دقیقه در دماهای متفاوت در حمام آب بررسی شد. مقـدارهای مشخصی از آنـزیم در بـازههـای زمـانی متفـاوت برداشـته شـد و بلافاصله فعالیت آن اندازه گیری شد. فعالیت باقی مانده بر حـسب درصد کاهش نسبت به فعالیت اولیه گزارش میشود ]۲.[
تعیین وزن مولکولی
وزن مولکولی آنزیم پراکسیداز بـهوسـیلهی ﮊل SDS – PAGE تخمین زده شد. انجام عملیات تحت شرایط غیر فعال سازی با اسـتفاده از ﮊل ۵ درصد پلی آکریل آمید است. باند پروتئین ایجاد شده بـا مـاده
کوماسی رنگ آمیزی شدند و وزن مولکولی ظاهری آن با اسـتفاده از اسـتاندارد وزن مولکـولی (Prestained Protein Marker Biolabs) تخمین زده شد ]۳.[
تعیین پارامترهای سینتیکی آنزیم پراکسیداز
پراکسیدازها عموما از هیدروﮊن پراکسید بـه عنـوان سوبـسترا استفاده میکنند ]۲.[ آزمایشهای سینتیکی همـانند روش سـنجش فعـالیت پراکسیـداز با غلظتهای متـفاوت هیــدروﮊن پراکـسیـد در گسترهی ٠ تا ٥/٢ میلی مولار و غلظت ثابت فنول تحت شرایطی مشابه با تعیین فعالیت انجام شد. مقدارهای ثابت میکائیلیس ـ منـتن، Km و Vmax، برای سوبستراهای فنول و هیدروﮊن پراکسید از نمودارهـای معکوس دوطرفه، مطابق با روش لینویور ـ برک به دست آمدند ]۶.[
نتیجهها و بحث
اثر ترکیب فاز
جدول ۱ نتیجههای به دست آمده از تفکیک آنزیم در ترکیـب درصدهای متفاوت را نشان میدهـد. ترکیـب فازهـا بـه صـورتی تغییر کردهاند که حجم فاز پایین (که برای انجام فرایندهای بعدی مــورد اســتفاده قــرار مــیگیــرد) کــاهش یابــد. سیــستم فــازی بـا ترکیـب ۴۲ درصـد وزنـی پلـی اتـیلن گلیکـول و ۳/۷ درصـد آمونیم سولفات، نتیجههای کلی مقبولی به صورت کـاهش حجـم فاز پایین (۰۶ درصد کاهش) و تفکیک پـذیری انتخـابی (۴۸۲/۰) با درصد بازیافت آنزیم قابل قبول (۲۱/۱۶ درصـد) دارد. در نتیجـه این ترکیب فازی در این مرحله از آزمایش به عنوان بهترین درصد انتخاب شد. توجه شـود کـه کـاهش بعـدی در حجـم فـاز پـایین (۰۸ درصـــد کـــاهش) در ســـامانهی فـــازی دارای ترکیـــب پلی اتیلن گلیکول ۷۲ درصد وزنی و آمـونیم سـولفات ۴/۶ درصـد وزنی بازیافت آنزیم بسیار ضعیفی (۷۴/۳۴ درصد) دارد و در نتیجـه برای بررسیهای بعدی در نظر گرفته نشد.
تاثیر غلظت سدیم کلرید
مشاهده شـد کـه غلظـت سـدیم کلریـد تـاثیر قابـل تـوجهی بر تفکیک آنزیم دارد. تاثیر غلظت سدیم کلرید در تفکیـک آنـزیم پراکسیداز تنهـا در سـامانهی فـازی بـا ترکیـب ۴۲ درصـد وزنـی پلی اتیلن گلیکول و ۳/۷ درصد وزنی آمـونیم سـولفات در جـدول ۲ نشان داده شده است. ضریب تقسیم پایین (۶۴۱/۰)، بازیافت آنزیمی بـالا (۲۸/۷۷ درصد) و کاهش حجم قابل قبـول فـاز پاییـن (۵۵) و
از همه مهمتر مرتبه تخلیص قابل توجه (۴۱/۳) در غلظت ۲ درصـد سدیم کلرید مشاهده شد. در نتیجه سامانه با ۲ درصد سـدیم کلریـد در مرحلههای تخلیص بعدی پراکسیداز مورد استفاده قرار گرفت.
تخلیص پراکسیداز
فعالیت ویژه آنزیم خام ۹۰/۳۳ U/mg است که مشابه بـا مقـدار آن در منابع مکتوب است ]۹.[ فعالیت آنـزیم خـام پراکـسیداز سـویا در مقایسه با آنزیمهای استخراج شــده از دیــگر منـابع گیــاهی کمتـر بوده ]۴،۵[ ولی فعالیت آن نـسبت بـه آنـزیم حاصـل از منبـع قارچی coprinus بیشتر است ]۷.[
جداسازی دوفازی آبی در اینجا به عنوان مرحله اول تخلیص بهکار گرفته شد که به هدف اصلی خود که افزایش مقدار تخلیص آنزیم (مرتبه تخلیص = ۴۱/۳) بود رسیـد در حـالی کـه حجم نمونه خـام به صورت قابـل قبولی (۵۵ درصد) کاهش یافت که در فرایندهای بعدی با مرحله کروماتوگرافی مورد استفاده قرار گرفت. شرایط استخراج به کار گرفته شده باعث افزایش فعالیت ویژه آنزیم (۲۹/۳۰۱) شد، که وابسته بـه تفکیک تفاضلی آنزیم مورد نظر و پروتئینهای آلوده کننده
٣٦ علمی ـ پژوهشی
