بخشی از مقاله
چکیده
یونهای سدیم و کلر معمولا شایع ترین یونهای موجود در خاک و آبهای شور هستند که باعث بروز تنش اسمزی، سمیت یونی و اختلال در تعادل یونی میشوند ژنهای فراوانی در فعال سازی مکانیسم های متنوع کاهش دهنده اثرات منفی شوری درگیرند و بررسی تغییرات الگوی بیان سبب آشکارسازی نقش این ژنها و محصولاتشان در تحمل تنش شوری و بدست آوردن راهکارهای موثر جهت ایجاد گیاهان زراعی مقاوم به شوری میگردد
در این تحقیق، آنالیز ترانسکریپتوم هالوفیت Aeluropus littoralisکه جزء مقاومترین گیاهان تک لپه نسبت به شوری است با استفاده از تکنیک cDNA-AFLP منجر به شناسایی الگوی بیان برخی ژنهای پاسخگو به تنش و ژن کدکننده پروتئین - tetratricopeptide repeat protein - TRP 27 گردید.
مقدمه:
شوری یکی از مهمترین تنشهای غیر زیستی است که سبب کاهش تولیدات زراعی در بسیاری از نقاط جهان میشود. با افزایش زمین های شور به دلیل مدیریت نادرست، زهکشی و آبیاری نامناسب و از طرفی افزایش تقاضا با توجه به افزایش روز افزون جمعیت جهان ایجاد گیاهان زراعی مقاوم به شوری به خصوص غلات که منبع مهم کربوهیدرات محسوب میگردند در سالهای اخیر مورد توجه بیشتری واقع شده است.
روشهای مرسوم اصلاح نباتات به علت پیچیدگی صفت مقاومت به شوری موفقیت محدودی داشته، بنابراین درک مکانیسم های مولکولی گیاهان متحمل به شوری بسیار حائز اهمیت است. توانایی گیاه جهت تحمل شرایط شور با کارآیی گیاه در درک تنش های محیطی و فعال کردن این مکانیسم ها تعیین می شود
گیاهان از مکانیسم های مختلفی شامل هموستازی یون، هموستازی اسمزی، کنترل تنش وتنظیم رشد جهت مدیریت شرایط تنش استفاده میکنند مثلا با محدود کردن جذب یون های سمی، حفظ جذب یون های ضروری و انتقال یونهای سمی به درون واکوئل بافت های خاصی به هموستازی یونی میرسند و تعادل اسمزی را از طریق جذب املاح مفید از خاک - مانند پتاسیم - و همچنین سنتز متابولیتها مکمل - مانند قندهای محلول، پرولین، گلاسین بتایین - در سلول ها ایجاد می کنند - 12،11،10،8،5، - 1 ودر واقع بیان شبکه ای از ژنها به طور هماهنگ در گیاهان متحمل سبب به حداقل رسیدن اثرات تنش و تنظیم محیط سلولی میگردد..
Aeluropus littoralis هالوفیتی است تک لپه از تیره پواسه که قابلیت رشد و سازگاری با محیط شور را به واسطه داشتن سیستم فتوسنتزی c4 ، غدد نمکی ، برگ های کوچک ، اپی کوتیل مومی و بالا نگه داشتن نسبت K+ /Na+ دارد. این گیاه از خویشاوندان وحشی غلات محسوب شده و به دلیل داشتن ژنوم کوچک و دوره رشدی کوتاه به عنوان گیاه مدل در شناسایی ژنهای پاسخگو به تنش و تعیین الگوی بیان آنها جهت سازگار نمودن گیاهان زراعی تک لپه مانند برنج، گندم و جو مورد توجه واقع شده و مطالعات در زمینه شناخت پایه های مولکولی سازگاری این گیاه به شرایط تنش به منظور بهبود اصلاح غلات ادامه دارد .
به منظور برطرف کردن مشکلات مرتبط با تکنیکهایی نظیرRap-PCR1و DD/RT-PCR2 که عمده ترین آن عدم تکرارپذیری و وجود تعداد زیاد باندهای مربوط به false positive است، تکنیک cDNA-AFLP تحت شرایط PCRابداع شد. این تکنیک نیاز به اطلاعات اولیه ندارد که بیانگر مزیت آن نسبت به میکرواری است و به دلیل حساسیت و تکرارپذیری بالا و عدم نیاز به اطلاعات اولیه تبدیل به روشی کارامد در آنالیز بیان ژن در گونه های غیرمدل شده است - . - 2 هدف از این تحقیق آنالیز ترنسکریپتوم هالوفیت Aeluropus littoralis با تکنیک cDNA-AFLP به منظور شناسایی ژنهای دخیل در سازگاری گیاه به شرایط شور انجام شد.
مواد و روش ها:
در این تحقیق بذور از منطقه رود دشت اصفهان جمع آوری و به صورت Sand culture کشت گردید و پس از 22 روز به محیط هیدروپونیک حاوی محلول هوگلند1/2 با محدوده PH 5/5-5/7 منتقل و برای هر سطح تنش سه تکرار در نظر گرفته شد و شرایط گلخانه ای به صورت 12 ساعت روشنایی و10 ساعت تاریکی با میزان رطوبت 60 درصد و شدت نور 15000 لوکس فراهم گردید.
مواد گیاهی پس از برداشت جهت جلوگیری از تجزیه RNA در ازت مایع و سپس در یخچال -80 تا زمان استخراج RNA نگه داری شدند. RNA استخراج شده از تکرارهای مختلف مربوط به هر سطح شوری جهت کاهش خطای آزمایشی بین تیمارها بایکدیگر ترکیب گردیدند.
برای تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده ازروش اسپکتوفتومتری و ژل آگارز استفاده شد و بر مبنای آن نرمال سازی RNA استخراج شده در هر تیمار صورت گرفت. از 500 نانوگرم mRNA استخراج شده جهت ساخت cDNA استفاده و پس از ساخت ss cDNA و ds cDNA هضم آنزیمی توسط EcoR وMseI به ترتیب در دمای 37 درجه به مدت 90 دقیقه و 65 درجه به مدت یک ساعت صورت گرفت و در مرحله بعد اتصال آداپتورها به صورت overnight انجام و مرحله تکثیر پیش انتخابی - Preselective - amplification باترکیبپرایمری شامل:
- FR5 +$ - 5'-GACTGCGTACCAATTCA-3' -
- FR5 +* - 5'-GACTGCGTACCAATTCA-3' -
0VH +& - 5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3' -
0VH +$ - 5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3' -
و برنامه 94 PCR درجه به مدت 30 ثانیه، 55 درجه 30 ثانیه و یک دقیقه 72 درجه برای 25 سیکل انجام و محصولات مرحله پیش تکثیر به میزان 1:10رقیق و با استفاده از آغازگرهای دارای سه باز انتخابی در انتهای 3' با برنامه 30 PCR ثانیه 94 درجه، 30 ثانیه 65درجه، یک دقیقه 72 درجه برای 12 چرخه با کاهش ./7 درجه کاهش دما در هر چرخه و 23 چرخه به صورت 30 ثانیه 94 درجه،30 ثانیه 56 درجه،یک دقیقه 72 درجه و 7 دقیقه 72 درجه انجام شد
پس از واسرشته سازی DNA در دمای 96 درجه به مدت 5 دقیقه ،الکتروفورز روی ژل اکریل آمید دناتوره 6 درصد به مدت 2 ساعت با ولتاژ ثابت 65 درجه انجام و از رنگ آمیزی نیترات نقره جهت مشخص کردن الگوی باندی استفاده گردید و در ادامه عکسبرداری ازالگوی باندی بدست آمده با استفاده از دستگاه دنسیتومتر Imaging densitometer - GS-800, BioRad, USA - صورت گرفت سپس باندهای انتخاب شده با استفاده از تیغ تیز و با اضافه نمودن مقداری آب به باند مورد نظر در سطح ژل، از ژل جدا شده و در یک تیوب پی. سی. آر. حاوی 70میکرولیتر آب استریل قرار گرفتند و به مدت 15 دقیقه در دمای 95 درجه انکوبه شدند وسپس به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند ودر نهایت 5 میکرولیتر از آن جهت تکثیر مجدد مورد استفاده قرار گرفت
شرایط واکنش PCR دقیقا مشابه مرحله تکثیر انتخابی بود. محصول PCR روی ژل آگارز الکتروفورز شد و پس از بازیافت قطعات DNA از ژل آگارز جهت تعیین توالی و کسب نتایج بهتر ، کلونینگ با وکتور pTZ57R/T انجام شد این حامل طولی به اندازه 2886 جفت باز دارد علاوه بر ژن مقاومت به آنتیبیوتیک آمپیسیلین، دارای ژن کدکننده lacZ است که اجازه شناسائی کلونهای نوترکیب - سفید - را با استفاده از سیستم انتخابی کلونهای سفید/آبی میدهدپس از انتخاب تک کلونیهای سفید جهت تایید تراریختی باکتری با یک جفت آغازگر M13 پی سی آر گذاشته شد - روشی مستقیم برای شناسایی باکتری های ترانسفرم شده - و سپسEST ها تحت M13 - افزایش طول هر EST به میزان 163bp - تعیین توالی شدند
نتایج و بحث
آنالیز افتراقی ترانسکریپتوم ژنهای القا شده در سطوح شوری .، 120، 250، 450 و 600 میلی مولار از نمک NaCl با استفاده از تکنیک cDNA-AFLP در مقایسه با سطح شاهد نشان داد که سطح شوری 250 میلی مولار بیشترین میزان بیان را داشته است.
شکل شماره :1 تعداد tdf های بیان شده در سطوح مختلف شوری
