بخشی از مقاله
چکیده
امکان شاخهزایی مستقیم در هفت رقم گندم نان - Triticum aestivum L. - گلستان، چمران، سبلان، آزادي، تجن، الوند و نوید با تهیه 4 نوع جداکشت حاصل از جنین نارس، یعنی اسکوتلوم، مریستم انتهایی، مریستم انتهایی بهمراه اسکوتلوم و مریستم انتهایی برش یافته بررسی شد. محیط کشت، MS غنی شده بهمراه ترکیباتی از سه تنظیم کننده رشد بنزیل آمینوپورین، ایندول استیکاسید و توفوردي بود. نتایج نشان داد که نوع ترکیبات هورمونی بطور معنیداري بر تعداد جوانه باززا شده و تعداد جداکشتهاي با شاخهزایی مستقیم چندگانه، تأثیر دارد و بهترین پاسخها از لحاظ این دو صفت در مریستم انتهایی بهمراه اسکوتلوم، با میانگینهاي 8/38 و 4/76 عدد و در محیط کشت حاوي mg/l / 2 mg/l 2,4-D 10BAP ، مشاهده شد. اختلاف بین ژنوتیپهاي مختلف در مورد شاخهزایی مستقیم معنیدار نبود. مسیر فوق در مدت
زمان 8-10 هفته به اتمام رسید که در مقایسه با روشهاي معمول، بسیار کوتاهتر میباشد.
واژههاي کلیدي: گندم نان، جنین نارس، مریستم انتهایی، شاخه زایی مستقیم
مقدمه
گندم اولین غله و مهمترین گیاه زراعی دنیاست و در بین غلات، آخرین گیاهی است که در آن تغییرات ژنتیکی صورت گرفته است و امکان انجام دستکاریهاي ژنتیکی در آن با مشکل مواجه است. یکی از مراحل مورد نیاز در مهندسی ژنتیک، کشت بافت است. از لحاظ تکنیک کشت بافت و با توجه به روشهاي معمول آن میتوان به معایبی چند از قبیل پروسه طولانی در بدست آوردن گیاه کامل، تنوع سوماکلون و همچنین اختصاصی بودن این روشها براي ژنوتیپهاي مختلف، اشاره نمود - 2،. - 1 در سالیانل اخیر بهینه سازي و استفاده از روشهایی که در آنها فرایند باززایی گیاهچه بصورت مستقیم و بدون فاز حدواسط کالوس صورت بگیرد بسیار مورد توجه قرار گرفته است - 2،1،. - 4 از مهمترین مزایاي این روش نسبت به باززایی از کشت کالوس میتوان به عدم وابستگی به ژنوتیپ و مدت زمان اشاره کرد. در صورت بکار گیري روش باززایی مستقیم با استفاده از جداکشتهاي مریستمی میتوان به حصول مزایایی از قبیل عدم وجود حالت شیمري در بین گیاهان باززا شده - بدلیل نرخ پایین تنوع سوماکلونی در بافتهاي مریستمی نسبت به بافت بالغ - و بالا رفتن راندمان گیاه تراریخته در جداکشت - بدلیل سرعت بالاي تکثیر در بافتهاي مریستمی - ، اشاره نمود - 3،2،. - 1 شناسایی و معرفی مناسبترین جداکشت و ترکیب تنظیم کنندههاي رشد گیاهی براي شاخهزایی مستقیم و کاهش طول دوره باززایی در گندم، از اهداف اصلی این تحقیق بود.
مواد و روشها
بذر هفت رقم گندم نان - Triticum aestivum L. - گلستان، چمران، سبلان، آزادي، تجن، الوند و نوید در گلخانه گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزي کرج در سال 1384 کشت شدند. پس از گذشت حدود دو هفته از گردهافشانی، جنینهاي نارس، به منظور تهیه جداکشتهامورد استفاده قرار کرفت. به منظور بهینهسازي شاخهزایی مستقیم چندگانه از 4 نوع جداکشت حاصل از جنین نارس، یعنی اسکوتلوم، مریستم انتهایی، مریستم انتهایی بهمراه اسکوتلوم و مریستم انتهایی برشیافته استفاده شد. بذور نارس استریل شده به مدت 4 تا 8 ساعت در داخل آب مقطر استریل و در دماي 4 درجه سانتیگراد در یخچال نگهداري شدند، این مسئله جداسازي جنین را بذور آسانتر میکند. در زیر لامینارفلو، جنینها از بذور جدا، و بر روي کاغذ صافی اتوکلاو شده مرطوب قرار گرفتند و جدا کشتهاي مختلف، تهیه شدند. در هر پتري دیش، 10 جداکشت مربوط به ارقام مختلف، قرار داده شد. پس از بستن در پتريها با پارافیلم، از هر تیمار محیط کشت سه تکرار در تاریکی و سه تکرار در شرایط نوري 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی نگهداري شدند.
روش تهیه محیط کشت بافت
چهار محلول الف، ب، ج و د دقیقاً منطبق بر محیط پایه موراشیگ و اسکوگ - 1962 - 1بود. در جدول 1، اجزاي تشکیل دهنده سه محلول دیگر، که جهت غنی نمودن محیط کشت، تهیه شد، ذکر شده است. تمامی محلولهاي ذخیره در یخچال نگهداري شدند.27 ترکیب هورمونی مختلف و یک تیمار کنترل، بر پایه محیطMS غنی شده براي جداکشتها استفاده شد .
مراحل ضدعفونی بذور نارس گندم
بذور نارس از خوشهها جدا و لما و پالئاي آنها حذف شد و بذور نارس به مدت 30 ثانیه در الکلال %70 قرار گرفته و تکان داده شدند. از این مرحله به بعد در شرایط کاملاً استریل، بذور با آب مقطر استریل یک مرتبه شستشو داده شدند و سپس به مدت 7 تا 10 دقیقه در هیپو کلریت سدیم %2.5 قرار گرفتند. در آخر3 مرتبه شستشوي بذور با آب مقطر استریل انجام شد.
طرح آزمایشی و تجزیه و تحلیل آماري
طرح کاملاً تصادفی بصورت فاکتوریل با سه تکرار و 10 جداکشت در هر تکرار براي تجزیه و تحلیل نتایج آزمایش، با استفاده از نرمافزارهاي آماري MSTATC, SAS و Excel صورت کرفت. براي مقایسه میانگینها از آزمون چند دامنهاي دانکن در سطح احتمال %5 استفاده گردید. پس از گذشت 14 و 30 روز از کشت، یادداشت برداريهاي مربوط به تأثیر ترکیب تنظیم کنندههاي رشد بر تعداد جداکشت با شاخه چندگانه در پتري دیش و تعداد شاخه در جداکشت در دو شرایط نوري، انجام شد.
نتایج و بحث
چهار نوع جداکشت حاصل از جنین نارس بر روي محیطهاي حاوي ترکیبات مختلف از تنظیم کنندههاي رشد کشت شد.
پس از دو هفته، تمایز شاخههاي متعدد، بخوبی مشاهد گردید - شکل. - 5 با بررسی نتایج بدست آمده در شاخهزایی مستقیم در گندم با استفاده از چهار نوع جداکشت میتوان گفت که، وجود نواحی مریستمی، براي شاخهزایی مستقیم از اهمیت ویژه-اي برخوردار است زیرا بافتهاي مریستمی، به علت تقسیم سریع سلولی، قدرت تکثیر و باززایی بالایی داشته منطبق می-باشد و از طرف دیگر، نسبت به بافتهاي مسنتر ، تنوع کمتري در خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی نشان میدهند پس از گذشت مدت کوتاهی، یعنی در حدود 6 تا 8 روز، باززایی مستقیم در همه جداکشتها مشاهده شد و گیاهچههاي حاصل زنده مانده و ناهنجاريهاي مورفولوژیکی در آنها مشاهده نشد. سه نوع جداکشت مریستم انتهایی همراه با بخش اسکوتلوم زیرین، مریستم انتهایی بدون بخش اسکوتلوم زیرین و مریستم انتهایی برش یافته جنین نارس که نسبت به جداکشت اسکوتلوم جنین نارس، نواحی مریستمی بیشتري دارند، در محیط حاوي 2mg/l 2,4-D و 10 mg/l BAP پاسخهاي بهتري را دادهاند که این نکته لازمه حضور سلولهاي مریستمی را براي شاخهزایی مستقیم بعنوان سلولهاي جوان و فعال مریستم از توانایی بهتري براي جنینزایی و تمایز برخوردارندا را مجدداً آشکار میسازد - مطابق با نتایج سعید و همکاران، . - 1997 در جداکشت اسکوتلوم جنین نارس، بهترین پاسخ براي هر دو صفت در محیط کشت حاوي 2mg/l 2,4-D و 14mg/l BAP بدست آمدهاست .تفاوت اساسی در بین این چهار نوع جداکشت، در سطوح هورمونی مناسب از سیتوکینینها - بنزیل آمینو پورین - ، مشاهده میشود که در مورد جداکشت اسکوتلوم جنین نارس، این مقدار 2 mg/l، افزایش نشان میدهد. در این خصوص،یک نکته قابل اهمیت تأثیر کاهش نقاط مریستمی در اسکوتلوم جنین نارس که خود منبعی براي انواع هورمونها ، بویژه سیتوکینینهاست. از دیگر نکات قابل بررسی، تاثیر نور بر شاخهزایی مستقیم میباشد. در بین دو تیمار نوري اعمال شده، قرار دادن کشتها از ابتدا در معرض تناوب نوري 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، نسبت به تیمار تاریکی مطلق براي چهار هفته، نتایج بهتري را حاصل نمود. علت این امر را میتوان به نقش مثبت نور در هدایت انتقال سلولهاي سماتیکی به سلولهایی که قادرند در قالب ساختارهاي جنینی شکل ظاهر شوند - مطابق با نتایج تورن و همکاران، - 2001، ارتباط داد. با توجه به نتایج، مشاهده میشود که اثر رقم، معنیدار نشده است. این مسئله یک مزیت مهم براي روش شاخهزایی مستقیم میباشد و با حذف مرحله حد واسط کالوسی،ل این روشها از زمان کشت تا باززایی گیاه کامل، حدود 60 تا 70 روز زمان لازم دارند، در حالی که روشهاي مبتنی بر کالوس،ل 3 تا 4 ماه بطول میانجامد - مطابق با نتایج شارما و همکاران، 2004 و یودس، . - 2004
شکل- تمایز چندین شاخه در جداکشت مریستم انتهایی بهمراه اسکوتلوم پس از گذشت 7 روز - - a، 30 روز - - b مریستم انتهایی بدون اسکوتلوم - - c، مریستم انتهایی برشیافته - - d ،
جدول–1 مواد و مقادیر لازم در تهیه محلولهاي ذخیره تغییر یافته
