بخشی از مقاله
چکیده
متابولیت های اکسیژن،ROS، بعنوان عامل ایجاد عقیمی در اسپرمها مورد توجه قرار گرفته است. در پزوهش حاضر، اثرات غلظتهای متفاوت از آنتی اکسیدان کوئرسیتین - 300 -2000 میکرومولار - ، بر ساختار غشاء، واکنش آکروزومی و درصد سلولهای اسپرم زنده بز مرخز در محیطهای حاوی یونهای آهن دوظرفیتی، به عنوان محرک پراکسیداسیون چربیها بررسی گردید. پراکسیداسیون چربیها به عنوان یکی از نتایج هجوم ROS به غشاهای زیستی مطرح بوده که ضمن آسیب رسانی به استحکام غشاء، موجب غیر فعال شدن آنزیمهای غشایی موثر در تحرک و فعالیت اسپرمها نیز می شود. نتایج این پژوهش نشان داد، کوئرسیتین در غلظت های کمتر از 1000 میکرومولار سبب محافظت از سلولها در مقابل آسیبهای ناشی از رادیکالهای آزاد محیط می شود که نتیجه آن بهبود وضعیت استحکامی غشاء، افزایش واکنشهای آکروزومی، و نیز بالا رفتن درصد اسپرمهای زنده در محیط است. همچنین اضافه سازی این محدوده غلظت کوئرسیتین باعث کاهش معنی دار میزانMDA - بعنوان یکی از محصولات نهایی روند پراکسیداسیون چربیها - محیط می گردد. از سوی دیگر، کوئرسیتین در محدوده غلظتی 1000 میکرومولار و بیشتراز آن نه تنها نقش حفاظتی و آنتی اکسیدانی نداشته بلکه ضمن ایجاد کمپلکس با یون های آهن، به عنوان یک پرواکسیداسیون عمل نموده و موجب بروز آسیب های فراوان در ساختار غشاء - با افزایش میزان MDA محیط - ، وکاهش درصد واکنشهای آکروزومی و اسپرمهای زنده می شود. محققین با عنایت به این رویکرد منفی کوئرسیتین، می بایست در زمینه هایی نظیرکشت،نگهداری و ذخیره سازی سلولهای جنسی، بطور جدی این مسئله را مد نظر داشته تا اثرات مخرب آنرا در سیستمهای زیستی به حداقل رسانند.
واژه های کلیدی:اسپرم بز مرخز- کوئرسیتین- پراکسیداسیون- واکنش آکروزومی- . MDA
مقدمه
متابولیت های اکسیژن مولکولی نظیر رادیکال هیدروکسیل و آنیون سوپراکسید قادرند با تاثیر منفی بر اعمال و ساختار سلولها، بقاء موجودات زنده را در معرض خطر قرار دهند و بعنوان یکی از عوامل ناباروری در مردان شناخته شوند - 3،. - 1 این متابولیتها از یک طرف جهت انجام برخی روندهای طبیعی نظیر واکنش آکروزومی اسپرمها ضروری بوده و از طرفی دیگر با افزایش غلظت آن در محیط، موسوم به استرس اکسیداتیو، موجب مهار قدرت تحرک و نیز تغییر در شکل ظاهری این سلولها می شود. بدین ترتیب درصدهای متفاوتی از ناباروری را ایجاد می نماید. یکی از تظاهرات مهم استرس اکسیداتیو در سلولها، پراکسیداسیون چربی غشایی می باشد. LPO یک پدیده پیچیده فیزیولوژیکی بوده ودر تمامی سلولهای غنی از اسیدهای چرب غیر اشباع، رخ می دهد و شامل مجموعه ای از واکنشها مانند تخریب و تشکیل مجدد پیوندهای دوگانه در ساختار آنها می باشد. روند LPO موجب تخریب ساختار غشاء، کاهش قدرت تحرکء مهار فعالیت های آنزیمی، و ایجاد شکستگی های متعدد در DNA سلولهای اسپرم شده، که حاصل آنها ایجاد ناباروری می باشد - 13،4،5،6،3،. - 1 آنتی اکسیدانها ترکیباتی هستند که با جمع آوری ROS ازمحیط، موجب خنثی سازی و حذف آنان از درون و برون سلولها می شوند. سلولهای اسپرم در طی اسپرماتوژنز، حجم زیادی از سیتوپلاسم و آنتی اکسیدانهای خود را از دست می دهند، و بدین ترتیب در مقابل روند پراکسیداسیون سلولی حساس می گردند - . - 24 امروزه استراتژی کاربرد آنتی اکسیدانها در راستای کاهش اثراکسیدان و رفع صدمات وارده به سلول، مد نظر محققان قرار گرفته است. کوئرسیتین به عنوان یک آنتی اکسیدان قوی که به تازگی مورد توجه متخصصان تولید مثل قرار گرفته است، از دسته فلاونوئیدها بوده که دارای ساختار آروماتیک هتروسایکلیک می باشد که اثر بخشی آن به عنوان آنتی اکسیدان به اثبات رسیده است. بیشتر خاصیت آنتی اکسیدانی این ماده به دلیل حضور ترکیبات فنلی بسیار قوی در آن می باشد.
هدف از انجام این پژوهش مطالعه اثر غلظتهای متفاوت کوئرسیتین در محیطهای حاوی سلولهای اسپرم بز مرخز تیمار شده با عامل القاء - پروموتر - LPO - محلول 0/2 میلی مولار سولفات آهن یا - Feso4 می باشد که نتایج آن با سنجش میزان LPO جهت بررسی ساختار غشاء اسپرم، هضم ژلاتین جهت تعیین در صد سلولهای اسپرم واجد واکنش آکروزومی و رنگ آمیزی با ائوزین جهت بررسی تعداد اسپرمهای زنده و فعال در بررسی ناباروری اسپرم مورد استفاده قرار گرفت.
مواد و روشها:
1 - آماده سازی محلولها و نمونه های اسپرمی: پژوهش حاضر بصورت In vitro برروی سلولهای اسپرم بز از نزاد مرخز انجام شد. نه نمونه اسپرمی - مایع منی خالص بدون ترکیبات نگهدارنده - از بزهای مرخز فارم تحقیقاتی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان گرفته شده و نمونه های مذکور به سرعت و در یک فلاسک حاوی یخ، به محل آزمایشگاه فیزیولوزی دام دانشکده علوم دامی دانشگاه علوم کشاورزی گرگان منتقل شد و پس از شستشو با محلول رینگر تایرود، دوبار سانتریفیوژ - 500 xg، هربار به مدت 10 دقیقه - تا پلاسمای منی از سلولهای اسپرم بطور کامل جدا گردد. رسوب اسپرمی در مقدار کمی محلول رینگر حل شد و در مراحل بعدی آزمایش مورد استفاده قرار گرفت.
2 - اندازه گیری میزان: LPO براساس روشOhkawa و همکارانش - - 12 انجام گرفت. در این روش پس از انکوباسیون نمونه ها به مدت 90 دقیقه در نهایت میزان تولید اسید تیوباربیتیوریک با اجسام واکنش دهنده ازجمله مالون دی آلدهاید MDA که در حدود 50 درصد از مقدار TBARS را شامل می شود، در محیط حاوی نمونه اسپرمی و در طول موج 532 نانومتر اندازه گیری شد. مخلوط واکنش شامل نمونه اسپرمی، سولفات دودسیل سدیم،
اسید استیک خالص، محلول 1/2 درصد TBA ، با یا بدون یونهای فلزی و کوئرسیتین می باشد. پس از حرارت دادن این مخلوط، 3 میلی لیتر از محلول ان بوتانول به اضافه پیریدین به آن افزوده و نهایتا، پس از سانتریفیوژ، میزان جذب نوری محلول فوقانی با اسپکتروفوتومتر مورد سنجش قرار گرفت.
3 - اندازه گیری پروتئین نمونه های اسپرمی: مقدار پروتئین نمونه ها به عنوان یکی از پارامترهای لازم جهت محاسبه میزان فعالیت ویژه MDA می باشد که با اندازه گیری جذب نوری نمونه ها با استفاده از سولفات دودسیل سدیم در طول موج 750 نانومتر بوسیله اسپکتروفوتومتر انجام و مقدار پروتئین نمونه ها محاسبه شد - . - 7
4 - آزمایش ائوزین: بمنظور تعیین درصد تعداد سلولهای اسپرم زنده و غیر زنده طی 90 دقیقه انکوباسیون، از روش رنگ آمیزی با ائوزین استفاده گردید. تعداد 400 عدد اسپرم توسط میکروسکوپ نوری معمولی برروی هر لام
شمارش گردید. اسپرمهای زنده فاقد خاصیت رنگ پذیری بوده و در مقابل اسپرمهای غیر زنده - بدون تحرک - به رنگ قرمز تا صورتی مشاهده شدند - . - 9
بررسی واکنش اکروزومی: تعیین در صد واکنشهای آکروزومی با استفاده از روش آزمایش هضم زلاتین انجام شد - . - 15 در این روش لام ها به مدت 2 ساعت با الکل شستشو و در یخچال نگهداری شد. سپس یک لایه نازک به قطر 100 - میکرولیتر - از محلول ژلاتین 2/5 درصد برروی آن گسترش داده شد. در مرحله بعد با قرار دادن لامها به مدت سه دقیقه در محلول 0,05 درصد گلوتار آلدئید، تثبیت گردیدند. جهت حذف مازاد گلوتارآلدئید لامها با آب مقطر شسته شده و بمدت 12 ساعت در یخچال نگهداری و سپس 50 میکرولیتر از نمونه های اسپرمی - تیمارشده با آهن و کوئرسیتین به صورت مجزا و یا با هم، و نیز گروه شاهد یا بدون تیمار بصورت مجزا - به سطح آنها اضافه گردید. لامها به مدت 24 ساعت در درون یک اطاقک مرطوب با دمای 39 درجه سانتی گراد نگهداری شد. بعد از این مدت، لامها با رنگ کوماسی آبی رنگ آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری معمولی - بزرگنمایی - 400 مورد بررسی قرار گرفت. سلولهای اسپرم واجد هاله - محل هضم ژلاتین که در اطراف سر اسپرمها در نتیجه واکنش آکروزومی پدید می آید - و نیز سلولهای بدون هاله شمارش و ثبت گردید. در صورتیکه بیش از 50 درصد سلولها واجد هاله باشند، می توان نتیجه گیری نمود که عملکرد سلولهای آن نمونه در جهت انجام واکنش آکروزومی طبیعی بوده است.
روش تجزیه و تحلیل آماری: در هر آزمایش، میانگین گروه های تیمار شده با گروه شاهد به کمک روش Students t-test و توسط نرم افزار SAS مقایسه گردید - . - 10
نتایج :
نتایج حاصل از سنجش میزان LPO ، نشان می دهد که اضافه نمودن پروموترLPO به نمونه های اسپرم بز مرخز منجر به افزایش معنی دار در گسترش LPO یا تولید MDA می گردد. این میزان افزایش وابسته به زمان بوده و سیر صعودی بخود می گیرد بطوریکه پس از سه ساعت انکوباسیون - در حرارت 37 درجه سانتیگراد - این افزایش بمیزان 69/23 درصد - - p<0/001 نسبت به مقدارMDA گروه شاهد منفی - بدون آهن و کوئرسیتین، در زمان صفر از انکوباسیون - بود. اضافه کردن غلظتهای 300 و 500 میکرومولار کوئرسیتین به محیط فوق موجب کاهش معنی داری در میزان MDA تولید شده گردید، بطوریکه میزان کاهش در غلظت 500 میکرومولار کوئرسیتین سه ساعت پس از شروع انکوباسیون در حد 24/25 درصد - p<0/01 - بود. جالب توجه آنکه، اضافه کردن غلظتهای بیشتر کوئرسیتین - 2000-1000 میکرومولار - به محیط واکنش،نه تنها موجب کاهش روند پراکسیداسیون نگردید بلکه موجب افزایش فزاینده ای در غلظت MDA شد، بطوریکه این افزایش - نسبت به شاهد مربوطه - در غلظت 2000 میکرومولار به 76/93 درصد - - p<0/001 رسید. درصد اسپرمهای زنده و فعال بز مرخز طی دوره سه ساعته انکوباسیون با یونهای آهن - پروموترLPO - ، بشدت کاهش یافت بطوریکه پس از دوره انکوباسیون، تعداد اسپرمهای زنده محیط به42/86 درصد در مقایسه با شاهد منفی رسیددرحضور غلظتهای کم کوئرسیتین - 300 و 500 میکرومولار - ، درصد اسپرمهای زنده در مقایسه با گروه شاهد مربوطه - در هر زمان ار انکوباسیون - افزایش یافت. این میزان افزایش در غلظت 500 میکرومولار کوئرسیتین و در سومین ساعت از انکوباسیون بمیزان 32/51 درصد - - p< 0/01 بود.
