بخشی از مقاله
چکیده
هدف از مطالعه حاضر تعیین تاثیر سطوح مختلف سیستئین بر روی پارامترهای عملکردی اسپرم در صفر و 2 ساعت پس از یخ گشایی منی گاو نر نژاد هلشتاین میباشد. در این تحقیق از 4 گاو نر هلشتاین 5-4 - ساله - سالم و با شرایط نگهداری و تغذیه یکسان استفاده شد. نمونههای منی با رقیق کننده تریس زرده تخم با میزان اسپرم 30×106 در هر میلیلیتر رقیق شده و -L سیستئین در سه سطح 0، 2 و 5 میلیمولار در هر تیمار آزمایشی بکار برده شد. تیمارها تحت شرایط یکسان منجمد شده و تا هنگام ارزیابی پس از یخگشایی در ازت مایع نگهداری شدند. پارامترهای تحرک پیشرونده، منحنی سرعت حرکت - VCL - ، میانگین سرعت حرکت - VAP - و سرعت حرکت در خط راست - VSL - اسپرمها در صفر و 2 ساعت بعد از یخ گشایی توسط آنالیزگر کامپیوتری - CASA - ارزیابی شدند. افزودن مقادیر 3 و 5 میلیمولار از -L سیستئین بویژه سطح 5 میلیمولار به رقیق کننده تریس زرده تخم مرغ، جهت محافظت از لطمات ناشی از سرما به منی گاو احتمالا میتواند باعث بهبود ویژگیهای عملکردی و میزان ماندگاری اسپرماتوزوآ و نهایتا سطح باروری شود.
واژه نامههای کلیدی: اسپرم- رقیق کننده- -L سیستئین- تحرک اسپرم
مقدمه به علت استفاده گسترده از اسپرم منجمد در صنعت پرورش گاو شیری، کلیه مراحل استحصال، عملآوری، ذخیره و انتقال منی از اهمیت ویژهای برخوردار است، با اینحال هنوز راندمان نگهداری منی از وضعیت مناسبی برخوردار نیست. تعداد زیادی از اسپرمها به علت آسیبهای وارد شده در طول انجماد/ یخ گشایی قادر نیستند که تخمک را بارور سازند. مراحل انجماد، نگهداری و یخ-گشایی اسپرم با استرس اکسیداتیوی حاصل از افزایش رادیکالهای آزاد مرتبط است - 10 - که سبب تغییرات فیزیکی و شیمیایی بر روی غشاء پلاسمای اسپرم میشود . - 6 - سیستئین یک اسیدآمینه سولفوردار است که گروه تیول آن DNAو غشاء اسپرماتوزوآ را در برابر استرس اکسیداتیوی محافظت میکند و همچنین در ساختار گلوتاتیون به عنوان عامل آنتیاکسیدانی عمل میکند. بنابراین از این اسیدآمینه میتوان جهت کاهش صدمات ناشی از رادیکالهای آزاد تولید شده در نتیجه فرآیند انجماد منی استفاده نمود. هدف از انجام این مطالعه تعیین تاثیر سطوح مختلف سیستئین بر روی پارامترهای دینامیکی اسپرم در صفر و 2 ساعت پس از یخگشایی منی گاو نر نژاد هلشتاین میباشد.
مواد و روش ها حیوانات و روش نمونهگیری
این تحقیق در مرکز اصلاح نژاد غرب و شمال غرب انجام شد. برای این منظور از 4 گاو نر هلشتاین 5-4 - ساله - سالم و با شرایط نگهداری و تغذیه یکسان اسپرمگیری شد. در مجموع 16 نمونه گیری منی 4 - مرتبه از هر گاو - توسط واژن مصنوعی انجام شد.
منی حیوانات قبل از انجماد ارزیابی شد و نمونههای منی که شرایط استاندارد - جمعیت بیش از 500 میلیون اسپرم در هرمیلی لیتر، تحرک پیشرونده بیش از%70 و ناهنجاری کمتر از - %10 را داشتند، جهت اعمال تیمارهای آزمایشی مورد استفاده قرار گرفت.
جهت حذف تفاوتهای فردی بین حیوانات، انزال گاوها - در هر تکرار - به نسبت یکسان ترکیب شدند.
فرآوری اسپرم
در مطالعه حاضر اسیدآمینه - L سیستئین Merck - ، آلمان - در 3 سطح 2، 3 و 5 میلیمول به نمونههای منی موجود در رقیقکننده تریس زرده تخم با تعداد 60×106 اسپرم/میلیلیتر پیش از انجماد افزوده شد و یک تیمار فاقد اسیدآمینه - شاهد - در نظر گرفته شد. نمونهها در پایتهای 0/5 میلیلیتری به روش دستی پر و توسط دستگاه پرس ویژه IMV - ، فرانسه - بسته بندی شدند. پایتها مطابق روش انجماد آن مرکز توسط دستگاه نیمه اتوماتیک فریزکننده Minitiub - ، آلمان - تحت شرایط یکسان منجمد شده و تا هنگام ارزیابی پس از یخگشایی در ازت مایع نگهداری شدند. بررسی پارامترهای دینامیکی اسپرم و تجزیه و تحلیل آنها بعد از یخ گشایی میزان تحرک پیشرونده، VCL، VAP و VSL، 200 اسپرم در هر نمونه، توسط CASA مجهز به میکروسکوپ فازکنتراست با بزرگنمایی Nikon - ×100، ژاپن - و دارای صفحه گرم، در زمانهای صفر و 2 ساعت ارزیابی شدند. دادههای بدست آمده از این آزمایش با استفاده از رویه GLM نرمافزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. تفاوت میانگین حداقل مربعات سطوح مختلف در سطح 0/05 مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج
با توجه به اینکه گروه تیول DNA، غشاء پلاسمایی و پروتئینهای غشاء داخل و خارج سلول اسپرماتوزوآ را در برابر آسیبهای ناشی از اکسیدانها و رادیکالهای آزاد محافظت میکند، بنابراین قبل از انجماد نمونههای منی از -L سیستئین، برای کاستن آسیبهای وارده در جریان انجماد منی استفاده شد. نتایج حاصل از این بررسی بیانگر عدم وجود اختلاف معنیدار در صفات مورد بررسی در بین نمونههای تیماری بلافاصله بعد از یخگشایی - ساعت صفر - بود - جدول - 1 که این نتایج با مطالعات پیشین 7 - ، - 9 مطابقت داشت. غشاء پلاسمایی اسپرم گاو و گوسفند سرشار از اسیدهای چرب غیر اشباع است، بنابراین در طی مراحل فرآوری و انجماد/ یخ گشایی در اثر افزایش عوامل اکسیدانی انواع اکسیژن فعال - ROS - اسیدهای چرب غیر اشباع دناتوره می-شوند بنابراین با آسیب دیدن غشاء پلاسمایی تردد منابع انرژی بویژه منوساکاریدها از محیط به داخل سلول مختل میگردد، به عبارتی کاهش منابع انرژی در دسترس سلول تحرک اسپرماتوزوآ را تحت تاثیر قرار میدهد . - 11 - نتایج به دست آمده از ارزیابی نمونهها پس از 2 ساعت انکوباسیون نشان داد که میزان تحرک پیشرونده در گروه سیستئین با سطح 5 میلیمولار نسبت به گروه شاهد بطور معنیداری بالاتر بود - P<0/05 - ولی در تیمارهای سیستئین با سطوح 3 و 5 میلیمولار ، تحرک کل در مقایسه با گروه شاهد بیشتر بود - P<0/05 - - جدول . - 1 این نتایج با مطالعات انصاری و همکاران - 5 - مطابقت داشت اما منطبق بر گزارشات مالو و همکاران - 7 - نبود. میزان VCL در ساعت دوم، در گروه -L سیستئین با سطح 5 میلی مولار نسبت به گروه شاهد بالاتر بود - P<0/05 - - جدول - 1 که مطالعات قبلی - 7 - نیز نتایج مشابهی در این خصوص گزارش کردند. برای سایر پارامترها بین گروهها
در زمان دوم ارزیابی تغیییر چشم گیری مشاهده نشد. پارامترهای دینامیکی اسپرماتوزوآ مانند تحرک کل، تحرک پیشرونده، VCL، VAP و VSL با نرخ باروری گاو همبستگی مثبتی را نشان میدهند . - 4 - دادههای حاصل از این مطالعه نشان دادند که افزودن آنتی اکسیدان -L سیستئین در ساعت اولیه تاثیری بر پارامترهای دینامیکی اسپرماتوزوآ ندارد که احتمال می رود این اسید آمینه در ساعت اولیه پس از یخگشایی نتواند اثر خود را بر سیستم متابولیسم و خنثی سازی عوامل اکسیدانی اعمال کند؛ این درحالیست که ارزیابی پارامترهای دینامیکی در 2 ساعت و در مقادیر 3 میلی مولار بر تحرک کل و 5 میلی مول نشان دهنده بهبود تحرک پیشرونده، تحرک کل و VCL بود؛ بنابراین با گذشت زمان این اسید آمینه قادر است با دخالت در سیستم پاکسازی رادیکالهای آزاد، پارامترهایی که با باروری همبستگی مثبتی دارند را نسبتا بهبود ببخشد. معنیدار شدنVCL حاکی از آن است که -L سیستئین بر هایپراکتیو شدن اسپرماتوزوآ تاثیر مثبتی دارد. به عبارت دیگر این تاثیر مثبت، توانایی حرکت اسپرماتوزوآ در موکوس سرویکال دستگاه تناسلی دام ماده و رسیدن به سایت لقاح را بهبود میبخشد 1 - ، 2، 3، . - 8 اگرچه پارامترهای VCL - بجز گروه -L سیستئین در ساعت دوم انکواسیون - ، VAP و VSL تغییر معنیداری مشاهده نشد اما نتایج نشان دهنده افزایش میزان این پارامترها با افزایش سطح این اسیدآمینه بویژه در ساعت دوم انکوباسیون است. بنابراین می توان نتیجه گرفت که با افزودن مقادیر 3 و 5 میلی مولار بویژه 5 میلی مولار از -Lسیستئین به رقیقکننده تریس زرده تخم مرغ میتوان صدمات وارده به منی گاو در حین فرایند انجماد را کاهش داده و احتمالا باعث بهبود سطح باروری و میزان ماندگاری اسپرماتوزوآ شد.
جدول :1 مقایسات میانگین تاثیر سطوح مختلف -L سیستئین بر پارامترهای دینامیکی اسپرماتوزوآ در ساعت صفر و 2 پس ازانجماد/ یخ گشایی گاو نر نژاد هلشتاین
