بخشی از مقاله
چکیده
تحقیق حاضر به منظور بررسی چندشکلی ژن های باروری GDF9 و BMP15 و تأثیر آنها بر میزان چندقلوزایی در بز مرخز انجام گرفت. در این پژوهش از تعداد 50 رأس بز مرخز بهطور تصادفی نمونه خون تهیه گردید. در جایگاه BMP15 فراوانی آللهای B و b به ترتیب 0/96 و 0/04، همچنین، در جایگاه GDF9 فراوانی آللهای A و a به ترتیب 0/68 و 0/32 برآورد گردید. نتایج نشان داد که ژن GDF9 بهصورت انفرادی دوقلوزایی را تحت تأثیر قرار نداد. اما جایگاه BMP15 نقش مهمی در دوقلوزایی ایفا نمود. همچنین ترکیب هاپلوتیپهای دو جایگاه نقش بارزی در دوقلوزایی داشتند.
کلمات کلیدی: بز مرخز، چند شکلی، هاپلوتیپ
.1 مقدمه
تولیدمثل یکی از مهمترین صفات اقتصادی در بز میباشد. دو یا چندقلوزایی از جمله صفات اقتصادی است که تحت تأثیر محیط و ژنتیک بوده و از شاخصهای مهم راندمان تولید در گوسفند به شمار میرود. اگرچه این صفت جزء صفات پلیژنیک میباشد، اما اخیراً ژنهایی شناسایی شدهاند بر روی این صفت دارای اثرات عمده هستند. تاکنون، سه دسته ژن به طور مؤثر بر رشد فولیکولها و نرخ تخمک اندازی شناسایی شده است، که عبارتند از ALK61، GDF92 و دسته BMP3 که معروفترین آنها BMP15 است. تمامی این ژنها جزو خانواده بزرگTGF- 4 بوده، که بر تنظیم بیان و ترشح هورمونهای مؤثر بر رشد فولیکولی و نرخ تخمک اندازی مؤثرند. ژن 2/5 GDF9 کیلو باز طول داشته، که شامل دو اگزون است و توسط یک اینترون به طول 1126جفت باز از هم جدا شدهاند، که کد کننده یک پیشپپتید به طول 453 اسیدآمینه بوده و پپتید فعال آن 135 اسیدآمینه طول دارد .[11]
ژن BMP15 شامل دو اگزون است، که توسط یک اینترون به طول 5/4 کیلو باز از همدیگر جدا میشوند. محصول رونویسی کامل آنها یک توالی 1179 نوکلئوتیدی بوده، که کد کننده یک پیشپپتید به طول 393 اسیدآمینه است و پپتید کامل آن 125 اسیدآمینه طول دارد .[8]ژنهای GDF9 و BMP15 برای پیشرفت مراحل اولیه فولیکولسازی و سپس در تکامل پایانی فولیکول بسیار حیاتی هستند .[9] این فاکتورهای ترشح شده اووسیت نقش مهمی در تمایز گرانولوزای مختلف [12] و در تنظیم اعمال کلیدی سلولهای گرانولوزا دارند .[15] لذا، اووسیت تمایز و عمل سلولهای گرانولوزا را کنترل میکنند و اثرشان روی الگوهای بیان ژن در سلولهای سوماتیک فولیکولی یک مکانیسم برای این امر است .[17]بنابراین، هدف از مطالعه اخیر بررسی چندشکلی احتمالی در اگزون دوم ژنهای BMP15 و GDF9 و ارتباط آنها با صفت چندقلوزایی در بز مرخز میباشدباشد.
.2 تئوری و پیشینه تحقیق
جهشهای مختلف در ژنهای BMP15 و GDF9 نرخ تخمک ریزی و ناباروری در گوسفند را افزایش میدهند. این جهشها در هتروزیگوتها باعث افزایش میزان تخمکریزی و دوقلوزایی و سهقلوزایی و در هموزیگوتها باعث نقص در فولیکولهای کامل شده و در نتیجه باعث ناباروری در بعضی نژادهای بارور گوسفند میشوند .[9,11] پژوهشگران چهار آلل موتانت از ژن - FecxB, FecxH, FecxI, FecxG - BMP15 را شناسایی کردهاند. تمام این آللها باعث افزایش میزان تخمکگذاری در گوسفندان هتروزیگوت و عدم باروری در گوسفندان هموزیگوت حامل این موتاسیونها میگردد .[8,11]محققین نشان دادند گوسفندان کمبریج و بلکلیر که حامل یک موتاسیون در ژن GDF9 - FecGH - در اگزونهای 1 و 2 هستند، باعث افزایش میزان تخمکگذاری در گوسفندان هتروزیگوت و عدم باروری در گوسفندان هموزیگوت میگردد. همچنین، گزارش گردیده است، که یک نسخه از FecGH باعث افزایش 1/4 میزان تخمکگذاری در گوسفندان کمبریج و بلکلیر می گردد .[8,10]
.3 مواد و روشها
نمونههای مورد استفاده در تحقیق حاضر شامل 50 رأس بز مرخز ایستگاه تحقیقاتی بز مرخز سنندج میباشند، که به طور تصادفی انتخاب شدند. خونگیری از ورید گردنی در لولههای خلأ 5 میلیلیتری حاوی ماده ضد انعقاد EDTA انجام گرفت و تا قبل از استخراج DNA در دمای -20 درجه سانتیگراد در داخل فریزر نگهداری شدند. استخراج DNA از نمونههای خون به روش نمکی بهینه یافته [13] انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده به دو روش اسپکتروفتومتری و ژل الکتروفورز تعیین گردید. تکثیر قطعه 862 جفت بازی ناحیه اگزون 2 ژن BMP15 و همچنین قطعه 995 جفت بازی ناحیه اگزون 2 ژن GDF9 توسط آغازگرهای اختصاصی و با استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز - PCR - انجام گرفت.
واکنش تکثیر PCR در حجم 20 میکرولیتر شامل 2 میکرولیتر بافر 10X PCR، 1 میکرولیتر dNTP، 1 میکرولیتر Mgcl2، 0/5 میکرولیتر Taq DNA polymerase، 10/5 میکرولیتر DdH2O، 3 میکرولیتر DNA استخراج شده و 2 میکرولیتر مخلوط پرایمرها انجام گرفت. توالی آغازگرهای اگزون 2 ژنهای BMP15 و GDF9 در جدول - 1 - نشان داده شده است.شرایط دمایی PCR برای تکثیر قطعههای ژنی عبارت است از: 95 درجه سانتیگراد بهمدت 10 دقیقه جهت واسرشته شدن DNA الگو، 38 سیکل شامل 94 درجه سانتیگراد واسرشته سازی اولیه بهمدت 45 ثانیه، 62 درجه سانتیگراد برای ژن GDF9 و 61/5 درجه سانتیگراد برای ژن BMP15 به مدت 55 ثانیه برای اتصال آغازگرها به DNA و 72 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه برای سنتز DNA و همچنین جهت بسط نهایی 72 درجه سانتیگراد بهمدت 10 دقیقه انجام شد.
کیفیت تکثیر قطعههای موردنظر در واکنش PCR با استفاده از ژل آگارز 1/5 درصد مورد بررسی قرار گرفت.جهت هضم آنزیمی محصولات حاصل از واکنش PCR برای دو جایگاه ژنی مورد مطالعه از 6 میکرولیتر محصول PCR، 2 میکرولیتر بافر واکنش آنزیمی - 10X - ، 0/5 میکرولیتر آنزیم برشی +LQI و 11/5 میکرو لیتر آب دیونیزه استفاده شد. قطعات حاصل از هضم بر روی ژل آگارز 3 درصد الکتروفورز گردید. حیوانات بر اساس اندازه و تعداد باندها حاصل از هضم آنزیمی تعیین ژنوتیپ شدند.
فراوانی ژنی و ژنوتیپی، هتروزیگوسیتی یا تنوع ژنتیکی، تعادل هاردی واینبرگ، شاخص شانون، شاخص نئی، محتوای اطلاعات چندشکلی - PIC - ، و تعداد آللهای مؤثر و واقعی برای جایگاههای مورد نظر با استفاده از نرم افزار [14] POPGENE 3.2 محاسبه گردید. همچنین، جهت بررسی پیوستگی ژنوتیپهای دو جایگاه GDF9 و BMP15 و هاپلوتیپهای آنها بر میزان چندقلوزایی در جمعیت بز مرخز کردستان از مدل غیر خطی دوجملهای و رویه logistic نرمافزار SAS - نسخه 1َ - /9 استفاده گردید، که مدل آماری عبارتند از:yijk مقدار فنوتیپی هر یک از رکوردهای مشاهده شده، میانگین کل، sexi اثر ثابت جنس، GDF9j اثر ثابت جایگاه GDF9، BMP15k اثر ثابت جایگاه BMP15، GDF9i*BMP15j اثرات هاپلوتیپهای دو جایگاه GDF9 و BMP15، خطای باقیمانده است.
.4 نتایج و بحث
DNA استخراج شده با روش نمکی از کیفیت مطلوبی برخوردار بوده و عاری از آلودگی با پروتئین بود. پس از تعیین کیفیت DNA به منظور تایید تکثیر قطعه مورد نظر، محصولات PCR بر روی ژل آگارز 1درصد الکتروفورز شدند؟ مشاهده تنها یک باند ×862جفت بازی برای جفت آغازگر اول - BMP15 - و یک باند×ُُِ جفت بازی برای جفت آغازگر دوم - GDF9 - نشان دهنده تکثیر درست قطعات انتخاب شده ژنها و صحت انجام PCR میباشد، که با نتایج بهدست آمده از پژوهش [17] Xue-qin et al مطابقت داشت.×عدم وجود کشیدگی و شفاف بودن باندها نشان دهنده عدم وجود آلودگیهای پروتئینی و نمکی میباشد و مشاهده تنها یک باند، عدم وجود باندهای کاذب را مورد تأیید قرار داد. شکل - - 1 و . - 2 -
