بخشی از مقاله
چکیده:
اهمیت سرعت بخشیدن رسیدن پنیر موجب توجه به تحریک لیز کردن سویههای استارتری به منظور کمک به آزادسازی آنزیمهای درون سلولی مؤثر در تشکیل عطر و طعم شده است. در این مطالعه از فرایند اولتراسوند با شدت %80 و فرکانس 20 کیلوهرتز برای لیز کردن سویههای لاکتوکوکوس لاکتیس و لاکتوباسیلوس کازئی استفاده شد و اثر عصاره استخراجی بر پروتئولیز و تسریع رسیدن پنیر مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده از آزمایشات نشان داد که استفاده از اولتراسوند باعث افزایش ازت محلول درpH =4/6 نمونه های پنیر نسبت به نمونه شاهد گردید. ارزیابی الکتروفورز هم نشان داد که با استفاده از عصاره آنزیمی باندهای پروتئینی بخصوص بتاکازئین بیشترین تجزیه را داشتند. در حقیقت عصاره آنزیمی بدست آمده، پروتئولیز پنیر را در مقایسه با نمونه شاهد به میزان قابل توجهی تشدید کرد و استفاده از اولتراسوند میتواند برای تسریع رسیدن پنیر بسیار مؤثر واقع شود.
واژه های کلیدی: لیز شدن"،" اولتراسوند"، "پروتئولیز و تسریع رسیدن پنیر.
مقدمه:
رسیدن پنیر عبارتست از نگهداری آن به مدت 2-3 ماه در درجه حرارت 0-16 درجه سانتی گراد که در طی آن خصوصیات فیزیکی و شیمیایی و باکتریولوژیکی آن تغییر پیدا کرده و باعث ایجاد طعم و مزه و بافت و بدنه مشخص می شود. مهمترین تغییرات بیوشیمیایی که در حین رسانیدن اتفاق می افتد شامل پروتئولیز، لیپولیز و گلیکولیز است . - 3 - پروتئولیز یا هیدرولیز پروتئینهای شیر مهمترین و پیچیده ترین واکنشی است که در طول رسیدن پنیر اتفاق می افتد و به دو مرحله پروتئولیز اولیه و ثانویه تقسیم می شود . - 9 - آنزیم های پروتئاز شرکت کننده در این فرایند به همراه رنت و پروتئاز شیر باعث هیدرولیز نسبی کازئین می شوند و در اصلاح بافت و عطر و طعم پنیر رسیده مؤثر هستند. انواع زیادی از باکتریهای اسید لاکتیک 1 - LAB - ، بزرگترین شرکت کنندگان در سیستم آنزیمی پنیر هستند.
پروتئازها در سلول های موجود در دیواره سلولی یا در فضای بین سلولی باکتری های اسید لاکتیک وجود دارند پپتیدازها نیز در غشای سلولی و همچنین در سیتوپلاسم این سویه های استارتری موجود هستند . - 10 - توانایی گونه ها به لیز شدن و پس از آن خروج آنزیم های درون سلولی آن ها یک ویژگی مطلوب در رسیدن پنیر محسوب می شود. آنزیم های خروجی طی لیز شدن نقش کلیدی در تشکیل اسیدهای آمینه مولد ترکیبات طعمی بازی می کنند و این دسته از گونه ها برای تشکیل طعم در محصولات لبنی تخمیری مورد توجه هستند . - 6 - فرایند لیز شدننسبتاً آهسته بوده و بالا بردن سرعت لیز شدن می تواند موجب تسریع رسیدن پنیر شود. از جمله روش های مختلف برای تسریع آزاد سازی آنزیم های داخل سلولی می توان به روشهای مکانیکی، اولتراسوند، هموژنایزر با فشار بالا، تخریب فیزیکی، آنزیماتیکی و روشهای ترکیبی اشاره کرد . - 2 -
اولتراسوند میتواند نقش مهمی در پیش برد بسیاری از فرایندهای مواد غذایی داشته باشد، استفاده از اولتراسوند موجب کاهش هزینه فرایند شده، بکارگیری آسانی داشته، محصول نهایی با خلوص بالا ایجاد میکند، سریع انجام می شود و همچنین مقدار کمی از انرژی و زمان مورد نیاز فرایند را بکار می گیرد و می تواند برای لیز کردن سویه های استارتری مورد استفاده قرار گیرد . - 11 - با توجه به اثرات مثبت لیز کردن سویه های استارتری به منظور تسهیل خروج آنزیم های درون سلولی و کمک به پروتئولیز و رسیدگی پنیر در این مطالعه از فرایند اولتراسوند برای لیز کردن سویههای لاکتوکوکوس لاکتیس و لاکتوباسیلوس کازئی استفاده شد و تأثیر آن بر پروتئولیز و رسیدن پنیر مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها:
شیر مورد استفاده برای تولید پنیر از مرکز خلعت پوشان دانشکده کشاورزی دانشگاه تبریز تهیه شد. مایه کشت مورد استفاده در این تحقیق مخلوط گونههای استرپتوکوکوس ترموفیلوس، لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس، لاکتوکوکوس لاکتیس زیرگونه کرموریس و لاکتوکوکوس لاکتیس زیرگونه لاکتیس و مایه پنیر قارچی میتو ساخت ژاپن بود. تمام مواد شیمیایی و محیط کشت MRS مورد استفاده در این تحقیق از شرکت مرک آلمان با درجه خلوص آزمایشگاهی تهیه گردید. سویههای باکتریایی که برای استخراج آنزیم مورد استفاده قرار گرفتند شامل سویههای لاکتوکوکوس لاکتیس و لاکتوباسیلوس کازئی بودند که از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه شدند.
تهیه پنیر
شیر گاوی تازه تحت عمل پاستوریزاسیون در دمای 65 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه قرار گرفت و تا دمای 37 درجه سانتی گراد سرد گردید، بعد استارتر مخلوط باکتری های لاکتیکی به وت شیر اضافه شد، بعد از 15 دقیقه رنت میتو اضافه و مخلوط گردید، سپس درب وت گذاشته شد و به مدت 45 دقیقه الی 2 ساعت زمان داده شد تا لخته مناسب تشکیل شود. بعد از گذشت مدت زمان مشخص عمل برش لخته در ابعاد مربعی انجام شد و بعد از گذشت چند دقیقه و خروج آب پنیر عمل آبگیری از دلمه توسط پرس انجام شد، در نهایت پنیر تولیدی برش داده شد و در آب نمک 24 درصد استریل گذاشته شد بعد از گذشت 24 ساعت قالب های پنیر در آب نمک 8 درصد به مدت یک هفته قرار داده شد تا به حالت نیمه رس برای انجام مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گیرند.
تهیه عصاره آنزیمی
سویه های باکتریایی که از پژوهشکده بیوتکنولوژی سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران تهیه شدند به صورت آمپول لیوفیلیزه بودند. برای فعال کردن سویه محتویات آمپول حاوی باکتری لاکتوباسیلوس کازئی لیوفیلیزه شده تحت شرایط استریل به لوله آزمایش دارای 10 میلی لیتر محیط کشت مایع MRS براث منتقل گردید و مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. سپس به ارلن حاوی 95 میلی لیتر از محیط کشت فوق منتقل شد و تحت شرایط ذکر شدهمجدداً انکوبه گردید. این عمل 2 تا 3 بار تکرار شد تا تعداد باکتریها به مقدار لازم برسد به همین ترتیب برای آمپول لیوفیلیزه لاکتوکوکوس لاکتیس مراحل تکرار شد . - 4 -
باکتری های کشت داده شده به همراه محیط کشت تحت عمل سانتریفوژ در دمای 4 درجه سانتی گراد 30 - دقیقه 26000 دور - انجام گرفت، بخش رویی بیرون ریخته شده و بر روی رسوب باقی مانده آب مقطر ریخته شد و دوباره عمل سانتریفوژ انجام شد، این عمل شستشو دو سه بار انجام گردید.به رسوب باقی مانده حدود 10 میلی لیتر بافر سدیم فسفات با pH =7 اضافه گردید،سپس عمل اولتراسوند با شدت 1 imp%80 و فرکانس20 کیلوهرتز و با 20 دور30 ثانیه ای داخل یخ انجام شد پس از اولتراسوند، عمل سانتریفوژ به منظور جدا کردن باکتری ها و سلول های لیز شده انجام شد و این بار رسوبات که حاوی لاشه باکتری ها بود دور ریخته شد و مایع رویی به عنوان عصاره آنزیمی خام برای تهیه پنیر اصلاح شده آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت . - 11 -
تلقیح عصاره استخراجی
یک کیلوگرم پنیر نیمه رس گاوی تهیه شده خرد شد و سپس با محلول استریل - دی سدیم هیدروژن فسفات - مخلوط گردید 50 - گرم دی سدیم هیدروژن فسفات در 325 میلی لیترآب مقطر حل شده - و با استفاده از میکسر دوغاب پنیر تهیه شد و سپس در 85 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه حرارت دهی انجام شد و سپس تا 45 درجه سانتی گراد سرد گردید و عمل تلقیح آنزیم ها انجام شد. آنزیم ها با استفاده از بافر فسفات با pH=7 به نسبت 1/10 حجمی-حجمی رقیق شدند و برای تلقیح آماده شدند . - 1 -
نمونه های پنیر به ترتیب با افزودن مقادیر%0/001 - تیمار - 1، %0/003 - تیمار - 2 و %0/005 - تیمار - 3 عصاره آنزیمی حاصل از سویه های لاکتوکوکوس لاکتیس و لاکتوباسیلوس کازئی و تیمار شاهد بدون افزودن عصاره حاصل به دوغاب پنیر تهیه شدند سپس در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1، 3 و 6 گرمخانه گذاری گردیدند در هر سه روز عمل نمونه برداری انجام شد و از نظر ازت محلول در pH =4/6 و الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید مورد بررسی قرار گرفت و آنالیز انجام شد.
آزمایش ها ارزیابی پروتئولیز
ارزیابی میزان پروتئولیز با استفاده از اندازه گیری ازت محلول به روش کوچورو و فاکس انجام شد - 5 - و درصد ازت محلول شاخص رسیدن محاسبه گردید. روش اختصاصی و کیفی برای ارزیابی میزان پروتئولیز در مورد محصولات لبنی روش الکتروفورز به روش شلابی و فاکس انجام شد . - 8 -
آنالیز آماری:
داده های حاصل از ارزیابی پروتئولیز با استفاده از طرح کرت خرد شده در زمان بر پایه طرح کاملا تصادفی با آزمون توکی و نرم افراز SAS نسخه 9,1 مقایسه میانگین شدند.
نتایج و بحث:
نسبت ازت محلول به ازت کل
نتایج حاصل از آنالیز واریانس نشان داد که غلظت عصاره مورد آزمایش و زمان گرمخانه گذاری و همچنین اثر متقابل آن ها تأثیر معنی داری - P 0/05 - بر روی درصد ازت محلول به ازت کل نمونه های پنیر نسبت به نمونه شاهد دارد. همانطور که در شکل 1 مشاهده می شود بیشترین ازت محلول در همه روز ها متعلق به تیمار 3 و کمترین آن متعلق به نمونه شاهد - بدون عصاره - بود. در حقیقت با افزایش غلظت عصاره مورد استفاده میزان پروتئولیز به طور قابل توجهی تشدید یافت که به دلیل تجزیه قسمت عمده مواد پروتئینی از شکل غیر محلول، به شکل محلول - واحدهای کوچکتر - می باشد . - 7 - در حقیقت استفاده از اولتراسوند موجب استخراج آنزیم های درون سلولی مؤثر در فرایند پروتئولیز شده است و با افزایش غلظت عصاره حاصل فرایند پروتئولیز نسبت به نمونه شاهد بیشتر افزایش یافته است.
الکتروفورز
نتایج حاصل از الکتروفورزالکتروفوروگرام های مربوط به الکتروفورز Urea Page نمونه های پنیر با غلظت های مختلف آنزیم در روز های 1، 3 و 6 گرمخانه گذاری در شکل 2 نشان داده شده است. هیدرولیز کازئین ها در همه نمونه های پنیر در طی گرمخانه گذاری اتفاق افتاد که با کمرنگ شدن تدریجی باندهای مربوط به s1 کازئین و همچنین کازئین و تولید ترکیبات حاصل از تجزیه آن ها قابل تشخیص است. افزایش شدت رنگ باندهای محصولات حاصل از تجزیه -α s1کازئین و همچنین کازئین نشان دهنده افزایش شدت پروتئولیز طی گرمخانه گذاری است. این امر با نتایج بدست آمده از ازت محلول مطابقت داشته که حاکی از معنی دار بودن - P 0/05 - اثر زمان گرمخانه گذاری و غلظت آنزیم ها بر شدت پروتئولیز است. همانطور که در شکل 2 مشاهده می شود -کازئین بیشتر از -α s1کازئین تجزیه شده است که این امر ممکن است به دلیل اثرگذاری بیشتر آنزیم های موجود در عصاره استخراجی لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوکوکوس لاکتیس بر -کازئین باشد.
