بخشی از مقاله
چکیده
در این تحقیق سویه هاي بومی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس از 20 نمونه از ماستهاي منطقه استان اردبیل جداسازي گردید. روشهاي فنوتیپی نیز بطور ذاتی داراي محدودیتهایی همانند قابلیت تکرار پذیري پایین و قدرت تمایز کم بین سویهها بوده و اغلب تحت تاثیر شرایط محیطی قرار میگیرند و روشهایی دقیق براي شناسایی باکتري در سطح جنس و گونه نیستند. شناسایی دقیق تر و بدون اشتباه این باکتريها فقط در سایه روشهاي ملکولی میسر میباشد. که به منظور شناسایی گونههاي لاکتوباسیلوس روشهاي ملکولی همانند تکثیر ژن RNA ریبوزومی، ریبوتایپینگ، هیبریداسیون و روش RFLP-PCR، معرفی شده است.
به منظور شناسایی باکتريها در سطح استرین نیز میتوان از روشهایی همانند Restriction Enzyme - REA - Analysis، RAPD، AFLP، - Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE را مورد استفاده قرار داد. در این مطالعه از تلفیق دو روش ملکولی تکثیر توالی جزئی ژن 16S rRNA و شناسایی به کمک روش PCR-RFLP استفاده گردید. با استفاده از این آزمایشات 12 جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس خالص سازي گردید که نتایج بدست آمده از آنها با خصوصیات ذکر شده در کتاب باکتري شناسی سیستماتیک روشهاي برگی و نمونه شاهد مثبت مطابقت داشت. این اولین گزارش کشوري از جداسازي جدایه هاي لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس از ماست هاي بومی استان اردبیل می باشد.
کلمات کلیدي: گرم مثبت، هموفرمنتاتیو، 16S rRNA
مقدمه
پروبیوتیک در زبان یونانی به معنی»براي زندگی « میباشد. این واژه براي اولین بار توسط Stillwell و Lilly در سال 1965 براي میکروارگانیسم هایی که اثر مثبتی در رشد و تعادل فلور میکروبی روده داشتند به کار گرفته شد. این افراد آن را متضادآنتی بیوتیک میدانستند که پس از آن دانشمندان دیگري از جمله تعریف جامع تري از آن ارائهدادند - . - 6 پروبیوتیک ها در مواد لبنی مثل انواع شیر، ماست، انواع پنیر، دوغ، بستنی و خامه ترش یافت می شوند که ماست هاي پروبیوتیک علاوه بر تامین باکتري هاي زنده، مواد مغذي مانند کلسیم و پپتیدهاي بیولوژیک را در اختیار میزبان قرار می دهند. مطالعات نشان داده است که باکترهاي پروبیوتیک موجب کاهش لاکتوز، کلسترول و فشار خون می شود. از سرطان روده و کبد، از التهاب روده اي، عفونت ها و اسهال حاد جلوگیري می کند.
امروزه از میکروارگانیسمهاي بسیار متعددي جهت تولید پروبیوتیکها استفاده می نماید سویه هاي که متداول جهت تولید اینگونه محصولات، شامل گروه هتروژنی از باکتري مولد اسید لاکتیک مثل لاکتوباسیلوس، انتروکوك ها و بیفیدوباکترها میباشد - . - 7 وجود تضادهاي زیادي در مورد باکتري لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بین نتایج دانشمندان باعث شد که به این نتیجه برسند که براي شناسایی این ارگانیسمهاروشهاي شناسایی زیادي لازم است. همچنین بعضی از دانشمندان براي تفاوت گذاشتن بین ارگانیسمها روي یک خصوصیت بیشتر تاکید می کردند که بیشتر آنها از تست تخمیر قند استفاده کردند.در سال 1953 دانشمندي بنام Berigs تلاش زیادي براي تقسیم بندي جنس لاکتوباسیلوس انجام داد که این ارگانیسمها را در 8 گروه اصلی بوسیلهي تست هاي فیزیولوژیکی همانند تولید گاز، قابلیت زنده ماندن در 60 و 65 ºC به مدت 30 دقیقه و رشد در 15، 45 و 48 ºC تقسیم کرد.
این خصوصیات بیشتر براي توصیف باکتريهاي اسید لاکتیک بکار میرود و همچنین این روشها پیچیده و وقت گیر می باشند - 1 و . - 7 روشهاي فنوتیپی نیز بطور ذاتی داراي محدودیتهایی همانند قابلیت تکرار پذیري پایین و قدرت تمایز کم بین سویهها بوده و اغلب تحت تاثیر شرایط محیطی قرار میگیرند و روشهایی دقیق براي شناسایی باکتري در سطح جنس و گونه نیستند. شناسایی دقیق تر و بدون اشتباه این باکتريها فقط در سایه روشهاي ملکولی میسر میباشد. مطالعات بمنظور جداسازي و شناسایی گونههاي لاکتوباسیلوس از محصولات لبنی توسط محققین مختلف انجام گرفته است.
که بمنظور شناسایی گونههاي لاکتوباسیلوس روشهاي ملکولی همانند تکثیر ژن RNA ریبوزومی، ریبوتایپینگ، هیبریداسیون و روش RFLP-PCR، معرفی شده است. به منظور شناسایی باکتريها در سطح استرین نیز میتوان از روشهایی همانند - Restriction Enzyme Analysis - REA، RAPD، AFLP، - Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE را مورد استفاده قرار داد، که در اینجا روشهاي شناسایی باکتري لاکتوباسیلوس در سطح گونه شرح داده شده است - 3 و. - 4 تحقیق حاضر نیز ابتدا با جستجوي اطلاعات از پایگاههاي اطلاعاتی مختلف و استفاده از نرم افزارها و برنامه هاي مختلفی مثل ,BLASTChromas - Technelysium - ,Alignment و غیره صورت گرفت.
مواد وروشها
در این آزمایش از محیط کشت هاي شامل: محیط کشت - MRS-Agarاین محیط کشت باکتریایی براي رشد و جداسازي انواع گونه هاي لاکتوباسیلوس به کار برده شد - ، محیط کشت - MRS-Sorbitol-Agarبراي رشد اختصاصی باکتري هاي لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ولاکتوباسیلوس کازئی استفاده شد - و محیط کشت - Phenol Red Broth Baseاین محیط کشت همراه با قندهاي مختلف براي تفاوت گذاشتن بین گونههاي لاکتوباسیلوس بر اساس واکنش تخمیر قند بکار برده شد - .براي استخراج DNA، ژنومی از لاکتوباسیلوس از روش پروتکل استاندارد - - Hafman and Winston 1987، با اندکی تغییرات استفاده گردید. سنتز آغازگرهاي طراحی شده، توسط شرکت سیناژن تهران صورت گرفت. طبق دستوالعمل شرکت، به پودر اولیه هر آغازگر، مقدار محاسبه شده آب دیونیزه استریل افزوده شد تا غلظت محلول پایه به 100mM برسد. به منظور استفاده از آنها در واکنش زنجیرهاي پلیمراز - - PCR از محلول پایه، غلظت 10mM تهیه شد. سپس تمامی الیگونوکلئوتیدها در دماي ºC -20 نگهداري شدند. که آغازگر مورد استفاده جهت انجام عمل PCR در این آزمایش در جدول -1 آورده شده است.
16S- و ژن23S rRNA با کمک آنزیم - Super polymerase Taqژن فن آوران - از روي ژن اصلی کپی برداري شد. آغازگرهاي مورد استفاده در این آزمایش نیز در جدول 2 نشان داده شده است.سپس نمونهها به دستگاه ترموسایکلر منتقل و دستگاه طبق برنامه راه اندازي شد و انجام مراحل PCR با مرحله داناتوراسیون اولیه به مدت 5 دقیقه در - Hot star - 95 ºC آغاز گردید. و با انجام 35 سیکل متوالی - 95 ºC به مدت 30 ثانیه، 65 ºC به مدت 20 ثانیه، 72 ºC به مدت 1 دقیقه - و در پایان 72 ºC به مدت 5 دقیقه به اتمام رسید. در اینجا از ژل آگاروز - ژن فن آوران - 1 درصد اتیدیوم بروماید در الکتروفروز براي مشاهده محصول تکثیر شده استفاده گردید . بمنظور انجام تکنیک RFLP-PCR ، و شناسایی جدایه هاي نوع A، مواد مورد نیاز واکنش RFLP مخلوط گردید سپس در دماي 37 ºC، در داخل ترمومیکسر به مدت 1 ساعت قرار داده شد. پس از انجام این مرحله محصول مرحله قبل که بوسیله آنزیم برشی Alu برش داده شده را روي ژل آگارز 1 درصد لود کرده سپس ژل را در دستگاهUV Gel document گذاشته شده و عکسبرداري ازآن صورت گرفت.
نتایج و بحث
در این مطالعه سعی گردیده سویههاي بومی باکتري لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس جداسازي شود. لذا ضمن انتخاب و نمونه برداري از ماستهاي متفاوت چند روستاي اطراف منطقه استان اردبیل تعداد 20 نمونه ماست جمع آوري گردید و باکتریهاي موجود در آنها در روي محیط کشت MRS-Agar، کشت داده شد. در این مطالعه 46، جدایه باکتري لاکتوباسیلوس جداسازي شد. و نتایج بدست آمده مشخص کرد که از بین باکتریهاي لاکتوباسیلوس 23 عدد از جدایهها روي این محیط کشت رشد یافتند که این جدایههاي رشد یافته باکتري لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و لاکتوباسیلوس کازئی بودند. DNA ژنومی جدایههاي نوع A حاصل از نتایج تست غیر مولکولی با جدایه شاهد یکسان بود و بررسی نتایج بدست آمده از تکثیر توالی جزئی ژن 16S rRNA، جدایههاي نوع A در طی عمل PCR مشخص کرد که طول توالی هاي جزئی ژن 16S rRNA، تقرباًی500 جفت باز می باشد مشابه با نمونه شاهد - شکل . - 1
ژن 16S rRNA، باکتري لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس داراي 1527 جفت باز میباشد که بمنظور شناسایی کمپلکس اسیدوفیلوس میتوان از توالی جزئی ژن 16S rRNA، استفاده کرد و مشخص شده است که این توالی که طول آن 500 جفت باز میباشد توسط پرایمرهاي اختصاصی PIB16 و MIB16، در طی عمل PCR تکثیر مییابد - . - 2 این قسمت داراي منطقههاي متنوعی از V1 و V2، بطول 195 جفت باز میباشد که براي شناسایی کمپلکس اسیدوفیلوس بکار میرود. بیشترین تنوع در منطقه 50 جفت بازي V1، بوده که براي تفاوت گذاشتن بین استرینهاي اسیدوفیلوس کافی است البته توالی 195 جفت بازي منطقه V1 و V2، باعث اطمینان بیشتر در تفاوت گذاشتن بین استرین هاي اسیدوفیلوس میشود. این روش در سال 2000 توسط کولن و هکارانش به عنوان یک روش سریع و مطمئن براي شناسایی اعضاي کمپلکس اسیدوفیلوس معرفی شد. نتایج بدست آمده مشخص کرد که همه جدایههاي نوع A، بجز جدایه شماره 37، در طی عمل PCR، با پرایمرهاي اختصاصی PIB16 و MIB16، یک باند 500 جفت بازي را دادند که نتایج بدست آمده با گفتههاي کولن و همکارانش در مورد کمپلکس اسیدوفلوسی کاملاً مطابقت داشت.
