بخشی از مقاله
چکیده
درتحقیق جاری، سویه های انتروکوکوس از پنیر سنتی لیقوان جداسازی شده و اثر آن در بهبود عطر و طعم پنیر سفید UF از طریق استفاده بعنوان کمک استارتر مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور 4 نمونه پنیر سنتی لیقوان از 4 کارگاه مختلف در منطقه لیقوان خریداری شد. با استفاده از محیط کشت اختصاصی، سویه ها جداسازی و با استفاده از روشهای استاندارد میکروبیولوژیکی شناسایی گردیدند. برای شناسایی گونه ها از تست تخمیر قند استفاده گردید. برای شناسایی گونه ها از تست تخمیر قند و شش نوع قند رافینوز، سوربیتول، آرابینوز، لاکتوز، ملی بیوز و سوربوز استفاده گردید. نتیجه این تحقیق نشان داد که سویه های غالب در این چهار نوع پنیر خریداری شده از لیقوان، انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم بودند. طوریکه در نمونه پنیر اول انتروکوکوس فکالیس، در پنیر چهارم انتروکوکوس فاسیوم سویه های غالب بوده و در پنیر دوم از پنج سویه، چهار سویه انتروکوکوس فاسیوم و در پنیر سوم چهار سویه انتروکوکوس فکالیس بودند.
کلمات کلیدی: انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکوس فاسیوم، پنیر لیقوان، پنیر سنتی، محیط کشت اختصاصی.
-1 مقدمه
باکتری های جنس انتروکوکوس، ارگانیسم هایی گرم مثبت، کاتالاز منفی، تخم مرغی شکل و غیر اسپورزا، بی هوازی اختیاری، هموفرمانتاتیو با احتیاجات غذایی پیچیده هستند - هیوکی، - 1998 که اغلب در اکثر سبزیجات، گیاهان و مواد غذایی مخصوصا غذاهای با منشاء حیوانی مانند محصولات لبنی حضور دارند. آنها هم چنین قسمتی از فلور میکروبی طبیعی روده بعضی از پستانداران و انسان را تشکیل می دهند - گیرافا، . - 2003 تعداد قابل توجهی از سویه های متعلق به گونه های متفاوت جنس انتروکوکوس دارای خواص بیولوژیکی یکسان مانند تولید باکتریوسین و رفتارهای پروبایوتیکی هستند.
چنین باکتری هایی قادرند که به صورت کلونی های تورفته از بقیه متمایز شوند و مقاومت استثنایی این باکتریها باعث توانایی رشد آنها در محیط خارج روده ای می گردد. از این رو در خاک، آب های سطحی، روی گیاهان و سبزیجات هم مشاهده شده - گیرافا، - 2002 و می توانند در محیط های هیپو تونیک، هایپر تونیک، اسیدی و قلیایی رشد کنند - هایوکی، . - 1998 دوام انتروکوکوس در طی رسیدن پنیر می تواند به محدوده وسیع رشد دمایی 10-45 °C، اسید 4-9 /6 - - pH و تحمل نمک - با غلظت 6 /5 درصد - NaCl نسبت داده می شود - اوگیر و همکاران، . - 2007 انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکوس فاسیوم و انتروکوکوس دورانس گونه هایی هستند که بیشترین فراوانی را در بین سایر گونه ها به خود اختصاص داده و به طور فراوان در محصولات لبنی یافت می شوند. بنابراین آنها می توانند نقش بسیار مهم در بافت و آرومای پنیر ایفا کنند - موراندی و همکاران، . - 2006 انتروکوکسی به عنوان بخش مهمی از میکرو فلور طبیعی بسیاری از فرآورده های لبنی تشخیص داده شده و در بعضی از پنیرها، آنها بر فلور لاکتوباسیل و لاکتوکوکسی غالب هستند - سوزی و همکاران، . - 2000
انتروکوکوس کاربردهای مهمی در صنعت لبنیات دارد و در تکوین خصوصیات ارگانولپتیکی در طی رسیدن بسیاری از پنیرها نقش ایفا می کنند. هم چنین از آن به عنوان مولفه اصلی در محیط کشت استارتر استفاده می شود - گیرافا، . - 2002 برای تائید این مساله، بسیاری از محققان ادعا نموده اند که انتروکوکوس می تواند دارای فعالیت های پروتئولیتیکی و لیپولیتیکی باشد و بنابراین می تواند نقش بسیار مهمی در رسیدن پنیر ایفا کند - نقل از مورنو، . - 2006 سویه های انتروکوکوس فکالیس فعالیت لیپولیتیکی و پروتئولیتیکی بیشتری نسبت به سایر سویه ها دارند. این میکروارگانیسم ها در مواد غذایی در طی نگهداری، تولید مواد آنتی میکروبیال - اسیدهای آلی مانند اسید لاکتیک و اسید استیک، اتانول، دی اکسید کربن، دی استیل - می کنند که مورد استفاده قرار می گیرند - مورنو، . - 2006
سویه ای از انتروکوکوس به نام E. faecium SF68 به عنوان پروبایوتیک در سوئیس استفاده شده که اثر کلینیکی موثری در جلوگیری از اسهال دارد و در فرآیند درمان اسهال در کودکان موثر شناخته شده است. اخیرا کمیته نظارت بر مواد غذایی در انگلیس1 استفاده از سویه E. faecium K77D را به عنوان استارتر محصولات لبنی تخمیری تائید نموده است - نقل از مورنو، . - 2006 باکتر یهای اسید لاکتیک توانایی تجزیه ترکیبات شیر به ترکیبات فرار و معطر را دارند و به همین منظور می توانند نقش مهمی در تکوین طعم و آرومای پنیر دارند - سونی و همکاران، . - 2003 تجزیه لاکتوز و سیترات طی رسیدگی پنیر باعث تولید ترکیبات فرار مانند استالدئید، اتانول، دی استیل، استون و استوئین می شود که منجر به تکوین آروما می گردد.
ترکیب فرار عمده تولید شده در شیر توسط سویه های انتروکوکوس فکالیس، فاسیوم و دورانس، استالدئید، اتانول و استوئین است. سویه های انتروکوکوس فکالیس و به مقدار کمتر انتروکوکوس فاسیوم، بیشترین مقدار این ترکیبات را تولید می کنند که اکثر آنها دارای منشا غذایی هستند. حضور انتروکوکوس در مقادیر بالا در پنیرهای مختلف و اثر آنها در کمک به بهبود ویژگی های ارگانولپتیکی مواد غذایی تخمیری و توانایی آنها در تولید باکتریوسین ها - انتروسین - خصوصیات مهمی هستند که باعث کاربرد آنها در تهیه مواد غذایی توسط فرآوری کننده ها می گردد. با استناد به مطالب ارائه شده و با توجه به اینکه در ایران نیز پتانسیل های خوبی برای تولید و فرآوری محصولات لبنی وجود دارد و با توجه به ذائقه خاص مردم ایران، زمینه های لازم برای بررسی و تحقیق بر روی سویه های بومی موجود در محصولات سنتی کاملا احساس می گردد.
-2 مواد و روش ها
-2-1 تهیه پنیر سنتی لیقوان
در مرحله اول 4 نمونه پنیر سنتی لیقوان از 4 منطقه و کارگاه مختلف از روستای لیقوان واقع در جنوب شرقی استان آذربایجان شرقی خریداری شد.
-2-2 جداسازی و شناسایی باکتری های انتروکوکوس
روش شناسایی در این تحقیق مبتنی بر روشهای فنوتیپی بود. روش کلی جداسازی و شناسایی باکتریهای انتروکوکوس به ترتیب زیر عملی گردید: با استفاده از روش های بیوشیمیایی، سوش های انتروکوکوس فکالیس و انتروکوکوس فاسیوم جداسازی و تعیین هویت شدند. برای جداسازی باکتری های انتروکوکوس از محیط کشت اختصاصی کانامایسین اسکولین آزید آگار به عنوان مناسب ترین محیط کشت برای شناسایی در نظر گرفته شد. در این محیط وجود کانامایسین به عنوان عامل انتخابی است. انتروکوک ها با هیدرولیز اسکولین تولید گلوکز و اسکولتین می کنند که در حضور سیترات فریک رنگ قهوه ای ایجاد می شود.
برای جداسازی انتروکوکها 5 گرم از پنیر مورد نظر توزین و سپس با 10 میلی لیتر بافر PBS مخلوط شده و به مدت چند دقیقه مخلوط و یکنواخت گردید. سپس بقیه رقتها از محلول همگن حاصل در اپندورف های حاوی 900 مایکرولیتر 0,1 PBS درصد استریل تهیه شد. رقتهای 10 -1 ، 10 -2 و 10 -3 در بافرPBS تهیه گردیدند. مقدار 300 میکرولیتر از هر رقت در یک پلیت کانامایسین اسکولین آگار پخش گردید. به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید. کلونی های رشد یافته در هر پلیت پس از سپری شدن مدت انکوباسیون مورد شمارش قرار گرفتند. سپس 5 کلونی بصورت تصادفی از پلیت هایی که به طور متوسط 30-100 کلونی در آنها شمارش شده بود، برداشته شده و مجددا روی همان محیط کشت اختصاصی کانامایسین، کشت سطحی داده شدند - سوزی و همکاران، . - 2000
-2-3 واکنش تخمیر قندها
برای شناسایی گونه های انتروکوکوس، واکنش تخمیر قندها برای تمامی جنس های جداسازی شده انجام گرفت. محیط کشت پایه مورد استفاده شامل LB براث فاقد گلوکز و عصاره مخمر بود که به آن 0,01 درصد کروزل قرمز به عنوان شاخص تغییر pH افزوده شد. محلول 1درصد از قندهای مورد نظر در محیط کشت مذبور تهیه شد. سپس پارافین افزوده شد تا تخمیر در شرایط کاملا بی هوازی صورت گیرد - لوپز و همکاران، . - 2000
نتایج
واکنش تخمیر قندها
به طور کلی برای شناسایی گونه های انتروکوکسی، تست مقاومت و تخمیر قند پیشنهاد شده است. از طرف دیگر گزارش شده است که استفاده از تیروزین دکربوکسیلاز، یک تست مناسب برای تشخیص انتروکوکسی از استرپتوکوکسی می باشد. اما به علت حلالیت کم تیروزین برای آزمایشات روتین مناسب نمی باشد - لی، . - 1972 شناسایی گونه های ویژه از جنس استرپتوکوکوس و انتروکوکوس توسط تست های فنوتیپیک سنتی در بسیاری از موارد امکان پذیر می باشد، هرچند در بین برخی گونه های یک گروه جواب نمی دهد - هاردی و همکاران، . - 1997
