بخشی از مقاله
چکیده: پنیر اصلاح شده آنزیمی پنیری است که در تولید آن از آنزیمهای پروتئاز، لیپاز و پپتیداز استفاده میشود. دراین مطالعه تأثیر آنزیمهای لاکتوباسیلوس کازئی و پلانتاروم در سه غلظت بر الگوی پروتئولیز در طی 1، 3 و 6 روز رسیدن مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده از این تحقیق نشان داد که مقدار ازت محلول درpH=4/6 در طول رسیدن پنیر افزایش یافت که این افزایش در روز 6 رسیدن بیشترین مقدار بود. نتایج حاصل از تجزیه نمونههای پنیر با استفاده از الکتروفورز کمرنگ شدن تدریجی باندهای مربوط به -αs1 کازئین و - کازئین و تولید ترکیبات حاصل از تجزیه آنها را نشان داد. ارزیابی ویژگیهای حسی در طول رسیدن پنیر، طعم تشدید یافته با کمترین تلخی را نشان داد که به دلیل آزادسازی آنزیم پروتئولیتیک و پپتیدولیتیک در نتیجه لیز شدن سلولی میباشد. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که این سویهها میتوانند در تسریع رسیدن پنیر ایفای نقش کنند.
واژه های کلیدی : پنیر اصلاح شده آنزیمی"،"لاکتوباسیلوس کازئی و پلانتاروم"،"آنزیم.
مقدمه:
پنیر اصلاح شده آنزیمی پنیری است که درتولید و فراوری آن از آنزیم هایی نظیر پروتئاز، پپتیداز، لیپاز و استراز در شرایط بهینه و کنترل شده استفاده می شود تا طعم پنیری تشدید یافته ایجاد شود. تولید پنیر اصلاح شده آنزیمی با مزایایی نظیر کاهش %80-40 در هزینه تولید، ایجاد طعم لازم بدون افزایش چربی، افزودن مقدار کمی از آن به غذا، ایدهآل بودن برای مواد غذائی منجمد، افزایش ظرفیت تولید، بهبود خواص عملکردی، افز ایش پایداری ماده غذائی، یکنواختی تولید، نیاز به فضای نگهداری کم، وجود همهی ترکیبات طعمی تولید شده در طول عملآوری پنیر طبیعی و تولید ترکیبات مفید تغذیهای نظیر پپتیدهای زیست فعال1 همراه میباشد . - 8 -
روشهایی که برای تولید EMC مورد استفاده قرار گرفته است عبارتنداز: افزودن آنزیم اگزوژنوس به دوغاب پنیر یا دلمه، استفاده از استارترهای اصلاح شده یا استارتر کالچر مکمل و بالا بردن دمای رسیدن . - 7 - اولین بررسی سیستم آنزیمی برای بهبود یا توسعهی طعم پنیر چدار با کشف لیپازها و پروتئیناز قارچی جدید توسط کوسیکوسکی - 7 - آغاز شد. در این راستا تحقیقات زیادی توسط فاکس - 1988 - ، کیلکاولی - 8 - ، آذرنیا، لی و همکاران - - 3، موسوی نسب، افشاری و رادی - 1 - و مهدی نیک خواه - - 2 صورت یافته است. و نتایج حاصل از آنها موید تأثیر مثبت تکنولوژی آنزیمی در تسریع زمان رسیدن و تقویت عطر و طعم ایجاد شده میباشد.
طیف گستردهتری از آنزیمها و سویههای میکروبی تجاری جهت تسریع توسعه عطر و طعم پنیر با استفاده از تکنولوژی EMC میتواند مورد استفاده قرار گیرند . - 13 - میکروارگانیسمهای مورد استفاده برای تولید این آنزیمها 2GRAS هستند و نیازی به خالصسازی محلول آنزیم نمیباشد. لاکتوباسیلها باکتریهای میلهای گرم مثبت متعلق به گروه باکتریهای لاکتیکی هستند که پتانسیل بالایی برای بهبود طعم پنیر دارند و تشدید طعم توسط آنها اثبات شده است . - 7 - بنابراین برای تولید بسیاری از پنیرها از سویههای لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس کازئی استفاده میشود. عملکرد این باکتریها شدیداً بر رسیدن پنیر و خصوصیاتی مثل پروتئولیز و لیپولیز موثر بوده است. تحقیقات زیادی نشان داده است که کشتهای حاوی لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس کازئی موجب افزایش پپتیدولیز پنیر و بهبود خواص حسی آن میشود 5 - و . - 6
بنابراین سویههای متعددی میتوانند به عنوان یک سیستم تحویل برای آنزیم های رسیدن مثل پروتئیناز، پپتیداز، لیپاز و استراز فعالیت کنند و باعث تقویت و تسریع فلیور و کیفیت پنیر شوند. از آنجاییکه این آنزیمها داخل سلولی بوده، نیازمند آزادسازی هستند. روشهای مختلفی برای آزادسازی محصولات داخل سلولی و لیز شدن وجود دارد. با اینحال یکی از گسترده ترین روشهای تخریب استفاده از سونیکاسیون میباشد. مکانیسم تخریب سلول در این روش با پدیده کاویتاسیون همراه میباشد و هدف اصلی از تخریب سلول تسریع واکنش پپتیدولیتیکی میباشد. در تحقیق صورت گرفته توسط درویتر و همکاران - 11 - در مورد تسریع رسیدن پنیر، لاکتوکوکوس لاکتیس لیز شد و اثر مثبت آن در تشدید پروتئولیز و تشکیل طعم دیده شد.
هدف از این تحقیق بررسی تأثیر آنزیمهای لاکتوباسیلوس کازئی و پلانتاروم بر تسریع زمان رسیدن و تشدید عطر و طعم بدون طعم تلخی پنیر گوسفندی میباشد.
مواد و روش ها:
مواد شیر مورد استفاده برای تولید پنیر سفید آب نمکی نیمهرس گوسفندی از منطقه لیقوان تهیه شد. مایه کشت مورد استفاده در این تحقیق مخلوط گونه های استرپتوکوکوس ترموفیلوس، لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس، لاکتوکوکوس لاکتیس زیرگونه کرموریس و لاکتوکوکوس لاکتیس زیرگونه لاکتیس و مایه پنیر قارچی میتو ساخت ژاپن بود. تمام مواد شیمیایی و محیط کشت MRS مورد استفاده در این تحقیق از شرکت مرک آلمان با درجه خلوص آزمایشگاهی تهیه گردید. سویههای باکتریایی که برای استخراج آنزیم مورد استفاده قرار گرفتند شامل سویههای لاکتوباسیلوس پلانتاروم - DSM 20174 - و لاکتوباسیلوس کازئی - ATTC 39392 - بودند که از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه شدند.
آماده سازی سویههای میکروبی محتویات آمپول حاوی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم لیوفیلیزه شده تحت شرایط استریل به لوله آزمایش حاوی 10 میلیلیتر محیط کشت مایع MRS منتقل گردید و مدت ×24ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید.×سپس به ارلن حاوی ×95میلیلیتر از محیط کشت فوق منتقل شد و تحت شرایط ذکر شدهمجدداً انکوبه گردید. این عمل 2 تا 3 بار تکرار شد تا تعداد باکتریها به مقدار لازم برسد. این مراحل به همین ترتیب برای آمپول لیوفیلیزه لاکتوباسیلوس کازئی تکرار شد . - 8 -
تهیه عصاره آنزیمی باکتریهای کشت داده شده به همراه محیط کشت به مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز منتقل شدند. سلولهای میکروبی توسط سانتریفوژ یخچالدار با دور 26000 J به مدت 30 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد برداشت شدند. به اینصورت که بخش رویی بیرون ریخته شد و رسوب باقی مانده دو سه بار با آب مقطر سانتریفوژ شد. رسوبات نهایی باقی مانده توسط ورتکس حل شد و به ارلن حاوی 10 میلیلیتر بافر سدیم فسفات با pH=7 منتقل شد، سوسپانسیون سلولی با دور 30×20 ثانیه، شدت %80 1 IMP و فرکانس 20 کیلوهرتز تحت عمل اولتراسوند قرار گرفت. سانتریفوژ سلولهای تخریب نشده پس از اولتراسوند به منظور جدا کردن باکتریها و سلولهای لیز شده در دمای 4 درجه سانتیگراد و 10000 J دور به مدت 10 دقیقه انجام شد و این بار رسوبات که حاوی لاشه باکتریها بود دور ریخته شد و مایع رویی به عنوان عصاره آنزیمی برای تهیه پنیر اصلاح شده آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت . - 15
تولید پنیر به روش سنتی ابتدا 10 کیلوگرم شیر گوسفندی تازه از منطقه لیقوان تهیه و بلافاصله به آزمایشگاههای موجود در دانشگاه تبریز منتقل گردید. شیر طی مدت 30 دقیقه تا دمای 65 درجه سانتیگرادگرم شد. سپس سریعاً تا رسیدن به دمای حدود 37 درجه سانتیگراد خنک گردید. در ادامه استارتر، مخلوط باکتریهای لاکتیکی به مقدار 0/1 گرم به ازای هر کیلوگرم شیر در مقداری شیر ولرم در پلیت حل و به شیر افزوده شد و به خوبی مخلوط گردید. شیر را حدود 15 دقیقه به حال خود باقی گذاشته و سپس 0/1 گرم مایه پنیر در مقداری شیر ولرم حل و به شیر افزوده شده و 3 تا 5 دقیقه به آرامی هم زده شد. پس از آن درب وت گذاشته شد و شیر تلقیح شده به مدت یک ساعت به حال خود باقی ماند تا عمل انعقاد صورت پذیرد. بعد از گذشت مدت زمان مشخص به منظور کامل شدن عمل آبگیری، دلمه به قطعات 1×1×1 سانتیمتر در دو جهت بریده شد. سپس به آرامی قطعات دلمه زیرو رو شده و به مدت زمانی به حال خود باقی ماندند. پس از آن لختهها جهت تکمیل آبگیری با قرار دادن وزنه بر روی دلمه پرس شدند. وزن پرس روی لختهها تقریباً معادل 0/1 وزن شیر مورد استفاده جهت تهیه لخته میباشد. مدت آبگیری در این روش 45 دقیقه بود. بلوکهای پنیر بعد از توزین به داخل آب نمک اشباع 24 درصد که از قبل تهیه و استریل شده بود، منتقل شدند. بعد از گذشت 24 ساعت قالبهای پنیر در آب نمک 8 درصد به مدت یک هفته قرار گرفتند و نمونهها سپس در ظروف نایلونی در فریزر -18 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا به حالت نیمهرس یا نارس برای انجام مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گیرد.
تولید پنیر اصلاح شده آنزیمی
برای تهیه EMC، 2-1 کیلوگرم پنیر نیمهرس گوسفندی خرد شده با محلول استریل دی سدیم هیدروژن فسفات 250 - گرم - مخلوط گردید 50 - گرم دی سدیم هیدروژن فسفات در 325 میلی لیترآب مقطر حل شد - . برای تهیه دوغاب پنیر از مخلوط کن استفاده شد و سپس در 85 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه حرارتدهی انجام شد و پس از آن تا 45 درجه سانتیگراد برای تلقیح آنزیمها خنک گردید. سپس عصاره آنزیمها با استفاده از بافرپتاسیم فسفات 0/05 مولار در pH =7/5 رقیق شد - 1/10V/V - و ترکیب دو آنزیم اضافه گردید و در دمای 30 درجه سانتیگراد بسته بندی و انکوبه شده و نمونهبرداری در روزهای 1، 3 و 6 گرمخانهگذاری انجام گرفت . - 3 -
عصاره پروتئازی حاصل از سویههای استارتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس کازئی در غلظتهای مختلف به پنیر تولیدی اضافه گردید و نمونهبرداری در روزهای 1، 3 و 6 گرمخانهگذاری انجام گرفت. 4 تیمار مورد آزمایش در روز اول گرمخانهگذاری مطابق جدول 1 در ترکیب با آنزیم پروتئاز با غلظتهای مختلف آورده شده است. 8 تیمار بعدی مورد آزمایش در طی روزهای 3 و 6 گرمخانهگذاری با غلظتهای آنزیمی مشابه روز اول بدست آمد.
جدول : 1 غلظت آنزیم مورد استفاده در هر تیمار.
ارزیابی پروتئولیز
ارزیابی پروتئولیزدر پنیرها با اندازه گیری ازت محلول در pH=4/6 و الکتروفورز انجام گرفت. نیتروژن محلول در4/6ّpH با روش اصلاح شده کوچرو و فاکس - 8 - استخراج شد؟ نیتروژن محتوی هر یک از محلولهای استخراجی با استفاده از روش کلدال تعیین شد؟ الکتروفورز اجزای نامحلول در pH=4/6 با استفاده از ژلهای اوره×؛پلی آکریل آمید - Urea-PAGE - با استفاده از دستگاه الکتروفورز با ژل عمودی و مطابق روش شلابی و فاکس - 14 - انجام شد.×10میلیگرم از فراکسیون نامحلول درpH=4/6 در یک میلیلیتر بافر نمونه - حاوی ×40درصد اوره - ×حل گردید و به میزانًٌ میکرولیتر به روی ژل انتقال گردید.×عمل الکتروفورز با استفاده از ولتاژ ×280و سپس ×300ولت تا رسیدن مارکر رنگی به انتهای ژل انجام گرفت. عمل رنگ آمیزی طبق روش توضیح G-250 با استفاده از کماسی بلو×صورت گرفت؟
روش طرح آماری طرح آماری مورد استفاده در این تحقیق کرت خرد شده در زمان1 در قالب طرح بلوکهای کاملأ تصادفی با سه تکرار است. تجزیه و تحلیل دادهها ومقایسه میانگین تیمارها با آزمون توکی توسط نرمافزار SAS نسخه 9/1 و رسم نمودارها با استفاده از نرمافزار Excel نسخه 2010 صورت گرفت.
میکس انجام شد. رتبه های 1، 2، 3 ، 4 و 5 به ترتیب به توصیفهای خیلی بد، بد، متوسط، خوب وخیلی خوب تخصیص داده شد . - 8 -
نتایج و بحث:
نیتروژن محلول
شکل 1 نسبت نیتروژن محلول در pH=4/6 به نیتروژن کل در نمونه های پنیر در طول رسیدن - به مدت 6 روز - را نشان میدهد. مطالعات انجام گرفته نشان دادهاند که ازت محلول در pH =4/6 شامل پیتیدهای متوسط و کوچک و اسیدهای آمینه میباشد. نوع تیمار مورد آزمایش و زمان گرمخانه-گذاری و همچنین اثر متقابل این دو فاکتور تأثیر معنیداری - P<0/05 - بر روی تغییرات درصد ازت محلول به ازت کل - %SN/TN - نمونه های پنیر داشته است. بطوریکه نمونههای حاوی عصاره پروتئازی بطور متوسط 17/6 درصد افزایش نسبت به نمونه شاهد داشتند و دلیل آن را فعالیت پروتئولتیک بالاتر سویهها دانستند. همانطوریکه از شکل 1 مشخص است مقدار ازت محلول در pH=4/6 در طول رسیدن پنیر افزایش نشان میدهد که این افزایش در روز 6 رسیدن بیشترین مقدار بود . - P<0/05 - افزایش تدریجی ازت محلول، توام با گذشت زمان موجب افزایش فاکتور رسیدن و در نتیجه رسیده شدن محصول میشود که به دلیل تجزیه قسمت عمده مواد پروتئینی از شکل غیر محلول، به شکل محلول - واحدهای کوچکتر - میباشد . - 12 - افزایش ازت محلول اثر متقابل تیمار و زمان گرمخانهگذاری را نشان میدهد. در مجموع مشاهده شد که بالاترین مقدار ازت محلول در pH=4/6
