بخشی از مقاله
چکیده:
پنیر خیکی یکی از پنیر های سنتی ایران است که درنواحی شمالی و شرقی ایران از شیرخام تهیه می گردد. محصولات شیری سنتی که با عدم فرآیند حرارتی شیر تولید می گردند بستر بسیار مناسبی برای رشد و فعالیت باکتری های لاکتیکی بومی فراهم می کنند، لذا دانش کامل از محصول لبنی نشاندهنده اولین گام به سوی بهبود کیفیت آن و در نتیجه گسترش محصول در بازار است. بنابراین ما در این پژوهش به جداسازی و شناسایی لاکتوباسیل ها اقدام نمودیم که نقش عمده ای در رسیدن و تعیین ویژگی های عطری و طعمی و بافتی پنیر ایفا می کنند.
برای دستیابی به این هدف، نمونه های مورد نیاز از پنیرهای سنتی خیکی طبق استاندارد AOAC 955.30 از روستاهای انگاس، سما، نیتل و صالحان در بخش کجور از توابع استان مازندران تهیه گردید. باکتری های اسید لاکتیک میله ای شکل به طور تصادفی از پلیت های حاوی محیط های MRS,Rogosa,MRS+Vancomycin,KAA,M17 جداسازی شده و ویژگی های آنها با روش های فنوتیپی تعیین گردید.
در پایان مطالعه 33 جدایه به عنوان لاکتوباسیل در نظر گرفته شد که لاکتوباسیلوس آگیلیس، لاکتوباسیلوس مالتارومیکوس، لاکتوباسیلوس پلانتاروم بیشترین فراوانی را داشتند. همچنین رشد بیشتر لاکتوباسیل ها در محیط کشت روگوزا نسبت به سایر محیط ها نشاندهنده اختصاصی بودن بالای این محیط برای این جنس از باکتری های اسید لاکتیک می باشد. از یافته های این مطالعه می توان در تولید صنعتی این پنیر یا حتی برای تولید یک پنیر جدید با عطر و طعم مشابه استفاده نمود.
مقدمه:
پنیر - محصول تخمیری شیر - یکی از گونه های لبنیات است که به طور گسترده در صدها نوع مختلف تهیه و در اکثر نقاط جهان مورد استفاده قرار می گیرد.دلیل اصلی تولید پنیر در روزگاران قدیم، دستیابی به محصولی با قابلیت نگهداری بهتر نسبت به شیر بوده است.اما امروزه این مسئله با ایجاد صنعت پیشرفته شیر کاهش یافته و خصوصیات ارگانولپتیک حائز اهمیت بیشتری شده است و در حقیقت، این ویژگی هاست که سبب افزایش تقاضای مصرف کنندگان امروزی می شود - مرتضوی و همکاران، . - 1388 پنیرهای تولیدی به روش صنعتی طعم پنیرهای سنتی را ندارند یا برخی از ویژگی های حسی شان بسیار ضعیف است .که این امر با پاستوریزاسیون شیر واستفاده از استارترهای تجاری مشخص در ساخت پنیرهای صنعتی مرتبط است.
پنیر های تولید شده ازشیر خام به روش سنتی پروفیل های طعمی گسترده تر و محسوس تری را نشان می دهند و خصوصیات ویژه این پنیرهاظاهراً نتیجه ای از تنوع جنسها وگونه های محلی و فلور میکروبی بومی ویژه شیر است - گارابال و همکاران، . - 2007 باکتری های اسید لاکتیک از عوامل اصلی تخمیر و ایمنی در پنیرهای سنتی هستند و در ایجاد طعم، بو و بافت نقش بسزایی دارند. این گروه از باکتری های شامل جنس های لاکتوباسیلوس، انتروکوکوس، استرپتوکوکوس، لوکونوستوک و لاکتوکوکوس می باشند که در این میان یکی از مهمترین جنس هایی که دارای ویژگیهای سلامتیبخشی نیز می باشد ،لاکتوباسیلوس است. لاکتوباسیلوس جزء فلور دستگاه گوارش انسان بوده و یکی از اجزای مهم میکروفلور طبیعی بدن انسان و حیوان به شمار میرود.
این دسته از باکتریها به ندرت با عفونتهای دستگاه گوارش در ارتباط هستند و سویههایی که از نظر اکولوژیکی مورد استفاده قرار میگیرند در دسته باکتریهایGRAS قرار دارند - سالمینه،1996نقل از خسروی دارانی و کوشکی، . - 1387 همچنین قادر به تولید ترکیباتی مانند اسیدهای آلی، دی استیل و باکتریوسین ها در حین تخمیر شیر می باشند. پنیر خیکی تولید شده در منطقه کجور یکی از پنیرهای سنتی ایران است که با استفاده از شیر خام تهیه می گردد و از طعم و آرومای بسیار مطلوبی برخوردار است. لذا هدف از این بررسی شناسایی و جداسازی لاکتوباسیلوس های موجود در پنیر سنتی کجور می باشد که نقش حائز اهمیتی در ایجاد بافت و طعم ویژه پنیر های سنتی دارند.
مواد و روش ها:
این پژوهش در مرکز تحقیقات فنی و مهندسی کشاورزی کرج انجام شد و کلیه مواد شیمیایی و محیط های کشت مورد استفاده از شرکت مرک آلمان تهیه گردیده است.
تهیه نمونه: در بهار 1391، نمونه های پنیر محلی خیکی - غیر پاستوریزه - با دوره رسیدگی 3ماهه از روستاهای انگاس، سما، نیتل و صالحان در بخش کجور از توابع استان مازندران طبق استاندارد AOAC 955.30 تهیه شد و در دمای 1-4°c با استفاده از cool box حاوی کیسه یخ در مدت زمان کمتر از 14 ساعت به آزمایشگاه انتقال داده شد - فکس و همکاران،. - 2000
رقت سازی :تهیه رقت از نمونههای پنیر در سرم فیزیولوژیک استریل - محلول % 0/9 نمک - NaCl و تا رقت 10-6 صورت گرفت - لیتوپائولو- تیزانتکی و تیزانکیس،. - 1992 کشت و گرمخانه گذاری:0/1 میلیلیتر از رقتهای تهیه شده بوسیله سمپلر بر سطح هر پلیت تزریق شد و به صورت پور پلیت در محیط های MRS,Rogosa,MRS+Vancomycin,KAA,M17 کشت داده شد. پلیت ها در دمای 30 و 37 درجه سانتی گراد به مدت 72 ساعت گرمخانه گذاری شدند.
جداسازی:پس از رشد کلنی ها بر روی محیط های کشت، ازپلیت های دارای بالاترین رقت کلنی هایی که از نظر مورفولوژیکی - رنگ، شکل و اندازه - مشکوک به لاکتوباسیلوس بودند را برداشته و پس از خالص سازی بر روی همان محیط های کشت قبلی از نظر کاتالاز، گرم و مورفولوژی سلولی و تولید گاز از گلوکز با لوله دورهام طبقBergy¸ s manual مورد بررسی قرار گرفتند. نگهداری کوتاه مدت از جدایه ها: پس از اطمینان از خالص بودن، کلنیها برای انجام آزمونهای مورد نظر استفاده شدند. به منظور نگهداری کوتاه مدت، کشت ذخیره ایزولهها در محیط کشت MRS broth منتقل گردید.و هر ماه یکبار کشت مجدد انجام شد. - عبدی و همکاران،. - 2005
آزمون های بیوشیمیایی: همانگونه که ذکر شد، آزمون های کاتالاز، گرم و مورفولوژی سلولی و تولید گاز از گلوکز با لوله دورهام برای تمام جدایه ها انجام پذیرفت. آزمون های رشد در دمای 10 و 45 درجه سانتی گراد - محیط کشت MRS broth، مدت گرمخانه گذاری 7روز - ، رشد در pH=4/4 و - pH= 9/6 محیط کشت MRS broth، مدت گرمخانه گذاری 5روز در دمای 30 درجه سانتی گراد، تنظیم pH اسیدی با اسیدسیتریک و تنظیم pH قلیایی با هیدروکسیدسدیم - و رشد در غلظت نمک %6/5 و %18 - محیط کشت MRS broth حاوی غلظت مورد نظر از نمک NACL، مدت گرمخانه گذاری 7روز در دمای 30 درجه سانتی گراد - طبق سالمینن - 1998 - انجام پذیرفت.
باسیل های کاتالاز منفی و گرم مثبت که قادر به رشد در غلظت نمک %18 نمی باشند را به عنوان لاکتوباسیلوس در نظر گرفتیم .برای شناسایی کامل تر باکتری های جداسازی شده در سطح گونه، آزمون رشد در دمای 15 و 45 درجه سانتی گراد، تولید آمونیاک از آرژنین - محیط کشت MRS broth،معرف مورد استفاده نسلر، مدت گرمخانه گذاری 2تا 7 روز در دمای بهینه رشد باکتری - و تست تخمیر کربوهیدرات ها در نظر گرفته شد. محیط کشت پایه مورد استفاده جهت تست تخمیر کربوهیدرات MRS broth فاقد گلوکز و عصاره گوشت بود که به آن 0/05% کلروفنل رد به عنوان شاخص تغییر pH افزوده شد. محلول 1% از کربوهیدراتهای مورد نظر در محیط کشت مزبور تهیه گردید.برای انجام تست تخمیر کربوهیدراتها و مقایسه آن با الگوی تخمیر باکتریهای لاکتیکی موجود در کتاب برگی، از کربوهیدراتهای آرابینوز،اسکولین،فروکتوز، گلوکز، لاکتوز،مالتوز،مانوز،ملی بیوز، رافینوز،رامنوز، ریبوز، سالیسیلین، ترهالوزو زایلوز استفاده شد.
نتایج و بحث:
مواد غذایی سنتی میراثی مهم برای یک منطقه محسوب می شوند که نشاندهنده ی یک فرصت بزرگ برای توسعه مناطق روستایی هستند. بخش کجور کوهستانی با پوشش گیاهی خاص خود می باشد،که بی شک بر ذخیره ی ژنتیکی میکروارگانیسم های منطقه بسیار تاثیر گذار خواهد بود.
نتایج حاصل از شناسایی در حد جنس : از مجموع جدایه های به دست آمده 33 جدایه به عنوان لاکتوباسیلوس شناسایی شدند که همگی باسیل های گرم مثبت، کاتالاز منفی و بدون اسپور بودند. از میان روستاهای انتخابی، %42 از جدایه های شناسایی شده از روستای انگاس به دست آمد که این نتیجه بر ویژگی های حسی بالاتر پنیر این روستا صحه می گذارد. طبق نتایج در جدول فوق، 48/48 %درصد از جدایههای لاکتوباسیل در این پژوهش از محیط کشت روگوزا بدست آمده بودند که بیانگر اختصاصی بودن بالای این محیط برای رشد لاکتوباسیلوس است، این نتیجه با حاصل پژوهش گونزالز و همکارانش - 2006 - همخوانی دارد.رشد مناسب لاکتوباسیل ها بر روی محیط MRS نیز مشاهده شد، زیرا به دلیل میزان انتخابی بودن پایین این محیط اجازه رشد جنس های مختلف از اسید لاکتیک باکتری ها را میدهد - نوید قاسمی زاد و همکاران، . - 2009 در نهایت محیط های M17،KAA ،MRS+van محیط مناسبی جهت رشد لاکتوباسیل ها ارزیابی نشد.
