بخشی از مقاله
چکیده:
لاکتوباسیلوسها به عنوان گونههای غالب در پنیرهای تهیه شده با شیر خام گزارش شدهاند، زیرا این میکروارگانیسمها قادرند تحت شرایط انتخابی شدید به رشد خود ادامه دهند و به دلیل ویژگیهای پروتئولیتیک عالی، نقش اساسی در ایجاد خصوصیات حسی محصول از خود نشان دهند. این پژوه با هدف جداسازی و شناسایی گونههای لاکتوباسیلوس از پنیر سنتی خیکی سوادکوه از توابع استان مازندران انجام گرفت. در این تحقیق با استفاده از روشهای فنوتیپی مجموعا 40 گونه لاکتوباسیلوس از 3 نمونه پنیر جداسازی و شناسایی شدند،
گونههای شناسایی شده از تنوع بالایی برخوردار بودهاند بطوریکه 40 گونه جدا سازی شده، متعلق به 23 گونه متفاوت لاکتوباسیلوس بوده است. گونههای لاکتوباسیلوس پلانتاروم زیر گونه پلانتاروم، لاکتوباسیلوس کازئی زیر گونه کازئی، لاکتوباسیلوس فرمنتوم، لاکتوباسیلوس دلبروکی زیر گونه بولگاریکوس، لاکتوباسیلوس هلویتیکوس، لاکتوباسیلوس سالیواریوس زیر گونه سالیواریوس، به عنوان گونههای غالب تشخیص داده شدند. با توجه به نتایج بدست آمده در این تحقیق میتوان دریافت که پنیرهای سنتی مناطق بکر شهرستان سوادکوه از نظر تنوع باکتریهای اسید لاکتیک بسیار غنی هستند و دارای کاربردهای بسیار مهم صنعتی میباشند.
واژگان کلیدی: لاکتوباسیلوس، جداسازی، شناسایی، پنیر سنتی
مقدمه:
پنیر یکی از پر مصرفترین فرآورههای شیری بوده و بسته به نوع آن دارای عطر و طعم ویژه و حاوی مقادیر متفاوت از ترکیبات عمده شیر از جمله پروتئین، چربی، آب، مواد معدنی و ویتامینها میباشد - Madadlou و همکاران، . - 2007 پنیرهای سنتی بسته به نحوه فرآوری آن، که در مناطق مختلف تا حدودی متفاوت میباشد دارای ویژگیهای حسی، فیزیکوشیمیایی و میکروبی متفاوت میباشنددر. تولید این پنیرها معمولاً از ترکیب شیر گوسفند، بز و یا گاو استفاده میگردد و به طور سنتی از شیر خام و بدون مایه کشت پنیر تولید می-شود - میرزایی و همکاران، . - 1390 پنیرهای سنتی گوسفندی به دلیل فعالیت آنزیمهای پروتئولیتیک و لیپولیتیک موجود در شیر و تولید شده توسط میکروفلور شیر خام دارای ویژگیهای منحصر به فردی از لحاظ خواص ارگانولپتیکی میباشد - میرزایی و همکاران، .1390 فرهنودی، - 1382،
به همین علت امروزه مطالعات گستردهای برای بهبود خواص کیفی و کمی این محصول انجام شده است تا جاییکه برای ارتقای سطح کیفی این فرآورده و تولید محصولات بازارپسندتر، توجه ویژهای بر روی این دسته از پنیرهای سنتی و محلی موجود در سراسر دنیا معطوف گشته است - احمدی و همکاران، . - 1387 این دسته از فرآوردههای سنتی لبنی، با تکیه بر تخمیرهای خودبخودی شیر یا با کشتهای غیر انتخابی تولید میشوند که این امر موجب تنوع وسیع محصولات با عطر و طعم، پایداری و کیفیت میکروبیولوژیک متفاوت میگردد. این فرآوردهها به عنوان منبع سوشهای نو و جالب برای استفاده در تخمیر شیر پیشنهاد شده-اند - Marin و همکاران، . - 2003
لاکتوباسیلوس یکی از مهمترین جنسهای باکتریهای لاکتیکی است که دارای ویژگیهای سلامتیبخشی میباشد، جزء فلور دستگاه گوارش انسان بوده و یکی از اجزای مهم میکروفلور طبیعی بدن انسان و حیوان به شمار میرود. این دسته از باکتریها به ندرت با عفونتهای دستگاه گوارش در ارتباط هستند و سویههایی که از نظر اکولوژیکی مورد استفاده قرار میگیرند در دسته باکتریهای GRAS1 قرار دارند - سالمینه، - 1996 این دسته از باکتریها گرم مثبت، کاتالاز منفی، بیهوازی تا کماکسیژنخواه و میلهای شکل هستند کهاکثراً تمایل به ایجاد زنجیره دارند؛ لذا قطر پرگنهها در سطح محیط کشت از یک میلیمتر تجاوز نمیکند. هرچند که این باکتریها پیگمانزا نیستند، ولی ممکن است به رنگ زرد یا قهوهای ظاهر شوند. میتوان لاکتوباسیلها را بر اساس ویژگیهای تخمیر به 3 دسته تقسیم کرد: الف - هموفرمانتاتیوهای اجباری1 شامل لاکتوباسیلهایی که گلوکز رامنحصراً به لاکتیک اسید تخمیر میکنند.×ب - هتروفرمانتاتیوهای اختیاری2 شامل لاکتوباسیلهایی که هگزوزها را به لاکتیک اسید تخمیر میکنند ولی از گلوکز گاز تولید نمیکنند. ج - هتروفرمانتاتیوهای اجباری3 که هگزوزها را به لاکتیک اسید، استیک اسید و یا اتانول و دیاکسید کربن تخمیر میکنند. تولید گاز از ویژگیهای بارز این گروه است - Walter and Hertel ،. - 2009
یکی از پنیرهای سنتی که در ییلاقات شهرستان سوادکوه از توابع استان مازندران تولید میشود، پنیر خیکی است که به دلیل داشتن عطر و طعم مطلوب و قوی، از بازارپسندی بالایی برخوردار استاین. نوع پنیر معمولاً از شیر خام گوسفند و بدون افزودن مایه آغازگر تهیه میشود. لذا یکی از مهمترین عوامل رسیدن و تولید عطر و طعم قوی این پنیر، فلور طبیعی شیرخام منطقه میباشد. با توجه به مطالب فوق و با عنایت به اینکه در کشور ما پتانسیل خوبی برای تولید و فرآوری محصولات شیر وجود دارد، زمینههای لازم برای بررسی و تحقیق بر روی سویههای بومی موجود در محصولات سنتیکاملاً احساس میگردد. هدف از این مطالعه بررسی حضور لاکتوباسیلوس به عنوان یک گونه از باکتری-های اسید لاکتیک در پنیر خیکی از منطقه سوادکوه میباشد.
مواد و روشها:
- 1 تهیه و جمعآوری نمونهها:
نمونههای مورد نیاز از پنیرهای سنتی خیکی مناطق ییلاقی شهرستان سوادکوه از توابع استان مازندران به میزان یک کیلوگرم از هر منطقه - شامل مناطق آلاشت، قلک و لفور - تهیه شد. در محل نمونهگیری ویژگیهای ظاهری و ارگانولپتیک نمونهها ثبت گردید و جهت رعایت شرایط بهداشتی و پیشگیری از تغییرات ناخواسته در تعادل فلور میکروبی، نمونهها را درون کیسههای استریل از جنس پلی پروپیلن - PP - 4 قرار داده و درب کیسهها را به وسیلهی دستگاه دوخت، محکم دوخت گرفته تا از نفوذ هوا به داخل آنها جلوگیری شود؛ پس از انتقال به آزمایشگاه میکروبیولوژی مواد غذایی مرکز تحقیقات فنی و مهندسی کشاورزی در شرایط مناسب تا زمان آزمایش در دمای 4درجه سلسیوس نگهداری شدند.
- 2 روش جداسازی و شناسایی:
تهیه رقت: برای تهیه رقت از نمونههای پنیر، 5 گرم از هر نمونه به طور جداگانه توزین و با 45 میلیلیتر سرم فیزیولوژیک استریل مخلوط شد، سپس به مدت 1 دقیقه با دستگاه استومکر، همگن شدند تا رقت 10-1 به دست آمد و برای تهیه رقتهای بعدی مورد استفاده قرار گرفت. رقتهای 10-2 تا 10- 6 در لولههای 90 میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل تهیه شد. 0/1 میلیلیتر از رقتهای تهیه شده بر سطح هر پلیت حاوی محیط کشت روگازا آگار کشت داده شد و سپس به مدت 72ساعت در دمای 30 درجه سلیسیوس گرمخانهگذاری شدند. بعد از به دست آوردن کلنیهای تک، از آنها اسلاید تهیه شده و با رنگ-آمیزی گرم و خصوصات ظاهری جدایههای باکتریایی شامل رنگ، قطر و شکل بررسی شده و در صورت مثبت بودن، بر روی آنها آزمایش کاتالاز انجام گرفته و در صورت تایید، کلنیهای مشکوک به لاکتوباسیلوس به صورت جداگانه روی محیط کشت یاد شده، کشت سطحی داده شند و مجدداً در شرایط مذکور گرمخانهگذاری شده تا عمل خالص سازی و جداسازی صورت گیرد Lopez-Diaz - و همکاران، . - 2000
بررسی ویژگیهای فنوتیپی جدایهها: برای شناسایی باکتریهای لاکتیکی، روشهای فنوتیپی شامل بررسیهای مورفولوژیکی و آزمونهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی کاربرد وسیعی دارند. بررسیهای مورفولوژیکی: پس از به دست آوردن کلنیهای تک و از نظر آزمون رنگ آمیزی گرم، فعالیت کاتالازی و مورفولوژی سلولی مورد بررسی قرار گرفتند - گریکو وهمکاران، - 2005و برای آزمونهای بعدی مورد استفاده قرار گرفتند. آزمونهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی: برای شناسایی جدایهها در حد گونه از آزمونهای زیر استفاده شد؛
- آزمون رشد در دماهای 15°C و :45 °C رشد جدایهها در محیط کشت MRS مایع در دماهای 15°C و 45 °Cبه مدت 7 روز گرمخانهگذاری بررسی شد - Bulut، . - 2003
- آزمون تولید گاز از گلوکز: به منظور بررسی توانایی تولید گاز، باکتری مورد نظر در لولههای آزمایش حاوی محیط کشت MRS مایع و لولههای دورهام تلقیح شد و پس از گرمخانه گذاری در دمای 30 درجه سلسیوس در طی 5 روز، وجود یا عدم وجود گاز در لوله دورهام بررسی گردید - . - Bulut, 2003
- آزمون هیدرولیز آرژینین: برای انجام این آزمایش از محیط کشت MRS مایع حاو آرژینین استفاده شد. یک لوپ از کشت ایزوله به محیط مذکور تلقیح شده و به مدت 2 الی 7 روز در دمای بهینه رشد میکروارگانیسم گرمخانه گذاری گردید. برای تشخیص تولید گاز آمونیاک، معرف نسلر1 بکار رفت. تغییر رنگ سریع به نارنجی نشانه تولید آمونیاک و عدم تغییر رنگ نشانه عدم هیدرولیز آرژینین در نظر گرفته شد - والتر و هرتر،. - 2009
- آزمون تخمیر کربوهیدراتها: به منظور شناسایی کاملتر جدایهها در سطح گونه تخمیر کربوهیدراتها شامل - گلوکز، لاکتوز، مانیتول، مانوز، گالاکتوز، سالیسین، آرابیوز، مالتوز، ملی بیوز، رافینوز، ساکارز، اسکولین، ریبوز، سربیتول، ترهالوز - در محیط پایه با فرمول زیر پیگیری شد - پروتئوز پپتون 10گرم، عصاره مخمر 5گرم، دی پتاسیم فسفات 2گرم، سدیم استات 5 گرم، منیزیم سولفات /02گرم، منگنز سولفات 0/05گرم، آب مقطر 1000میلی لیتر، 1 میلی لیترتوئین 80 و %0/05 کلروفنل به عنوان شاخص تغییر pH و%1 غلظت قند نهایی - انجام شد - . - Ranganna, 1993 نتایج آزمایشهای بیوشیمیایی جدایههای شناسایی شده با خصوصیات بیوشیمیایی باکتریهای اسید لاکتیک در کتاب برگی و کتاب جنسهای باکتری-های اسید لاکتیک مطابقت داده شد - اسنیث و همکاران، - 1986 و جدایهها در سطح جنس و گونه شناسایی شدند.
نتایج و بحث:
در این تحقیق با استفاده از روشهای فنوتیپی مجموعاً 40 سویه متفاوت از سه نمونه پنیر جمعآوری شده از مناطق مختلف سوادکوه شناسایی و جداسازی شدهاند. انواع سویههای شناسایی شده به تفکیک منطقه در جدول ذیل آمده است:لاکتوباسیلوسها به عنوان گونههای غالب در پنیرهای تهیه شده با شیر خام گزارش شدهاند، زیرا این میکروارگانیسمها قادرند که تحت شرایط انتخابی شدید نیز به رشد ادامه دهند و به دلیل ویژگیهای پروتئولیتیک عالی، نقش اساسی در ایجاد خصوصیات حسی محصول از خود نشان دهند - Torres-Llanez و
