بخشی از مقاله
مقدمه
فولیکولوژنزیس تخمدانی، فرآیندي پویا بوده که با تقسیم و تمایز قابل ملاحظه سلولهاي سوماتیک یعنی سلولهاي گرانولوزا مشخص می شود. فولیکول در حال تکوین، محیطی مناسب و مطلوب را جهت بلوغ تخمک فراهم می
آورد(.(7 هدف اصلی اووژنزیس، تولید تخمک شایسته از نظر رشدونموي با قابلیت باروري است. تخمک براي حصول باروري نیاز به ظرفیت از سرگیري میوز و قابلیت تکمیل آن تا مرحله ي متافاز ІІ (بلوغ هسته اي) دارد. در
228
in vivo
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
طول دوره جنینی، تخمک بدوي که خود حاصل تقسیمات میتوزي اووگونی است وارد میوز شده اما در مرحله دیپلوتن اولین تقسیم میوزي یعنی مرحله ژرمینال وزیکول متوقف می شود(.(19 بلوغ میوزي(بلوغ هسته اي) فرآیندي دو مرحله اي است که ابتدا تخمک اولیه، میوز را از سر گرفته و در متافاز تقسیم دوم میوزي متوقف می شود و در مرحله دوم تخمک ثانویه حاصل، در هنگام اوولاسیون و در صورت قرار گرفتن در معرض اسپرم، دومین تقسیم
میوزي خود را تکمیل نموده و تخمک بالغ را پدید
می آورد .(24) امروزه کشت آزمایشگاهی تخمک ( in ( vitro maturation یکی از مؤثرترین روشها در درمان
اختلالات باروري بوده و گامی مؤثر جهت کمک به بیمارانی چون مبتلایان به پلی کیستیک تخمدان و یائسگی زودرس است. متفورمین دارویی ضد دیابت از دسته ي
(باي گوانیدها) است که به طور گسترده اي به عنوان یک فاکتور حساس کننده به انسولین، در کنترل دیابت نوع 2
مصرف می شود .(15) متفورمین گلوکونئوژنز را می کاهد، که به کاهش برون دهی گلوکزي کبد می انجامد. سایر فعالیتهاي فارماکولوژیکی متفورمین، شامل افزایش اکسیداسیون گلوکز و ذخیره آن به صورت گلیکوژن و چربی است و نیز این دارو موجب مهار اکسیداسیون اسیدچرب می گردد. متفورمین جذب روده اي گلوکز را کاهش می دهد که به نرمال سازي میزان گلوکز خون کمک می کند(.(26 اثرات متعدد متفورمین در اکثر بیماران
PCOS منجر به کاهش مقادیر آندروژن محیطی، اعاده سیکلهاي قاعدگی و افزایش میزان اوولاسیون خود به خودي و تحت القاي کلومیفن سیترات شده است 17) و .(21 متفورمین می تواند فعالیت گیرنده تیروزین-کینازي انسولین را در انواع مختلف سلولها تغییر دهد(.(14
متفورمین همچنین موجب بهبود تنظیم سیکل قاعدگی، افزایش پاسخ دهی تخمدان به درمان با کلومیفن سیترات و القاي اوولاسیون می گردد(21 و .(25 بهبودي حاصل از تجویز متفورمین به افزایش حساسیت به انسولین، کاهش
مقادیر انسولین و متعاقب آن کاهش وضعیت هایپرآندروژنیک نسبت داده می شود.
زهر زنبور عسل شامل تنوعی از پپتیدها (شامل ملیتین،
آپامین، سکاپین، MCDP ، ترتیاپین، آدولاپین)، آنزیمها
(فسفولیپاز A2 ، هیالورونیداز،اسید فسفومنواستراز، لیزوفسفولیپاز)، آمینهاي فعال (هیستامین، دوپامین، نوراپی نفرین و سروتونین) و ترکیبات دیگر می باشد(.(5
مطالعات قبلی انجام شده توسط مؤلفین این مقاله (1) و
دیگر محققین نشان داده است که زهرزنبور در پیشروي تکوین فولیکولهاي تخمدان در محیط in vivo ، درمان
PCOS، درمان انسداد مجاري رحم و بهبود نتایج IVF
مؤثر است 2)، 3، 4، 5 و .(6 با توجه به اثر مثبت داروي متفورمین، در القاي اوولاسیون و رشدونمو فولیکولهاي تخمدان، در بیماران و تحت شرایط in vivo و in vitro و
با توجه به اثر مستقیم زهرزنبور عسل بر رشد و بلوغ
فولیکولهاي تخمدان و تخمکها در شرایط در این
تحقیق تأثیر توأم این دو به عنوان هدف اصلی کار انتخاب گردید تا هم افزایی آنها مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روشها
موشهاي نژاد NMRI با سن 14 روز انتخاب و به روش جابه جایی مهره هاي گردن کشته شدند. در محیط استریل موشها باز شده و تخمدانها جدا و در محیط کشت قطره اي
α-MEM حاوي FBS 5% تحت روغن مینرال قرار گرفتند. فولیکولهاي جدا شده از نظر داشتن تخمک گرد و مرکزي و داشتن لایه هاي سلولهاي گرانولوزا، غشاي گرانولوزا و لایه ظریف سلولهاي تکا و نیز قطر مناسب در زیر میکروسکوپ معکوس تحت بررسی قرار گرفتند.
فولیکولهاي مناسب، برداشته شده و به قطره هاي جدید حاوي محیط کشت α-MEM و تمامی مکملها FBS 5%) ، ITS 1% ، (FSH 100 mIU/ml و در زیر روغن مینرال منتقل شدند. سپس ظروف کشت حاوي فولیکولها به مدت
12 روز در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد و CO2 5%
229
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران)
نگهداري شدند 8) و .(22 قطر فولیکولها در روزهاي صفر، دوم و چهارم کشت توسط اکولر مدرج، با بزرگنمایی 100
میکروسکوپ معکوس و با محاسبه دو قطر عمود بر هم بر حسب میکرومتر تعیین شد .(8) با استفاده از تریپان بلو
0/4 درصد فولیکولهاي دژنره، آسیب دیده و زنده بر اساس شدت رنگ پذیري تعیین شدند و پس از پایان این مرحله و جمع بندي نتایج حاصله مناسب ترین اندازه فولیکولی جهت مطالعات بعدي اندازه بین 120 تا 170 میکرومتر در نظر گرفته شد. دژنره شدن فولیکولها توسط فاکتورهایی نظیر میزان رشد و پراکندگی سلولهاي گرانولوزا، تیرگی و روشنی سلولهاي گرانولوزا، چسبندگی فولیکولها به ظرف کشت، وجود فضاهاي مملو از مایع، تشکیل حفره آنتروم و عدم اوولاسیون زودهنگام، در طی 12 روز از کشت به صورت هر دو روز یکبار، در زیر میکروسکوپ معکوس بررسی شد .(20) جهت القاي تخمک گذاري و بلوغ تخمک، در روز دوازدهم، محیط قطره ها با محیط حاوي hCG 1 .5 IU/ml و rEGF 20 ng/ml تعویض شد 11) و (22 و 16 تا 48 ساعت بعد، چگونگی بلوغ تخمکهاي اووله شده بررسی گردید .(23) با توجه به اینکه هدف اصلی بررسی اثر همزمان زهر و متفورمین بوده است؛ غلظت مناسب براي متفورمین به منظور بلوغ آزمایشگاهی تخمک، غلظت 10-5 M در نظر گرفته شد((16؛ و از بین
دزهاي مختلف زهر زنبور پس از انجام آزمایشهاي
دزسنجی، غلظت 1 μg/ml براي آزمایش در این تحقیق مناسب تشخیص داده شد. تغییرات قطر فولیکول در روزهاي دوم و چهارم کشت، میزان بقا، دژنراسیون، تشکیل آنتروم و تعداد تخمکهايGV، MІ و MІІ به دست آمده در هر گروه و بین گروهها، با آزمون one way Anova در داخل گروه و بین گروهها سنجیده شد. از نظر آماري در آزمون هاي فوق (P< 0/05) معنی دار محسوب شد. براي آنالیز آماري و رسم نمودارها به ترتیب از نرم افزارهاي
SPSS و Excel استفاده شد.
جلد 26، شماره 3، 1392
*** 350
300 Diameters(micrometer)
** 250
control 200
metformin 150
100
50
0
day4 day2 day0
نمودار-1 مقایسه قطر متوسط فولیکولها بین گروههاي کنترل و
متفورمین در روزهاي دوم و چهارم کشت که حاکی از رشد معنی دار
فولیکولها در گروه متفورمین نسبت به گروه کنترل است.
(Mean ±SEM) (**P<0.01, ***P<0.001)
350
* 300 Diameters(micrometer)
* 250
200
control
BV 150
100
50
0
day4 day2 day0
نمودار -2 مقایسه قطر متوسط فولیکولها بین گروههاي کنترل و
زهرزنبور((BV در روزهاي دوم و چهارم کشت که حاکی از رشد
معنی دار فولیکولها در گروه زهرزنبور نسبت به گروه کنترل است.
BV = Bee venom (Mean ±SEM) (*P<0.05)
نتایج
قطر فولیکولها به مدت 4 روز در گروه کنترل و گروههاي تیماري متفورمین، زهرزنبور و هم افزایی متفورمین با زهرزنبور سنجیده شد. قطر متوسط فولیکولهاي گروه کنترل در روز دوم کشت برابر 171/52±29/73 μm و در گروه متفورمین برابر 209/67±14/4 μm می باشد که حاکی از اختلاف معنی دار((P <0/01 میان این دو گروه است. همچنین قطر متوسط فولیکولهاي گروه کنترل در روز چهارم کشت برابر 239/97±65/84 μm و در گروه متفورمین برابر 286/57±66/82 μm بود که اختلافی معنی دار((P <0/001 میان این دو گروه را نشان می دهد(نمودار
.(1 قطر متوسط فولیکولهاي گروه زهرزنبور در روز دوم کشت برابر 206/64±34/51 μm بود که حاکی از اختلاف معنی دار((P <0/05 بین این گروه با گروه کنترل است.
همچنین قطر متوسط فولیکولهاي گروه زهرزنبور در روز
230
مجله پژوهشهاي جانوري (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 3، 1392
چهارم کشت برابر 277/43±61/99 μm بوده که بیانگر تفاوتی معنی دار((P <0/05 میان این گروه با گروه کنترل است (نمودار .(2 قطر متوسط فولیکولهاي گروه هم افزایی متفورمین-زهرزنبور در روز دوم کشت برابر μm
215/89±27/16 بود که حاکی از اختلاف معنی دار(<0/05 (P بین این گروه با گروه کنترل است. همچنین قطر متوسط فولیکولهاي گروه هم افزایی متفورمین-زهرزنبور در روز چهارم کشت برابر 291/61±26/349 μm بوده که بیانگر تفاوتی معنی دار((P <0/01 میان این گروه با گروه کنترل است(نمودار .(3 بین گروههاي تیماري، از نظر تفاوت در قطر متوسط فولیکولها، هیچ اختلاف معنی داري مشاهده نشد. درصد زنده ماندن فولیکولها در گروه کنترل
64/10) درصد)، گروه متفورمین 71/11) درصد)، گروه زهر زنبور 59/09) درصد) و گروه هم افزایی متفورمین-
زهرزنبور 64/83) درصد) است که در هیچ گروهی نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی داري دیده نشد. درصد ماندگاري در گروههاي تیماري متفورمین و هم افزایی متفورمین-زهرزنبور افزایش و در گروه تیماري زهرزنبور کاهش یافته بود و بنابراین بین گروه تیماري متفورمین، با گروه تیماري زهرزنبور تفاوت معنی دار بود(.(P <0/05
درصد تشکیل آنتروم در گروه کنترل 46) درصد)، در گروههاي تیماري متفورمین(48/43 درصد)، گروه زهرزنبور(44/23 درصد)، و گروه متفورمین-زهرزنبور(46
درصد) است که هیچ اختلاف معنی داري میان گروهها دیده نشد. درصد تخمکهاي GV مشاهده شده در گروه کنترل 52) درصد)، در گروههاي تیماري متفورمین 31/25)
درصد)، گروه زهرزنبور(34/61 درصد) و گروه متفورمین-
زهرزنبور 33/9) درصد) بود (جدول .(1 درصد بقاي GV
در گروه تیماري متفورمین نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داري داشت (P <0/001) (نمودار .(4 درصد بقاي
GV در گروههاي زهرزنبور و گروه هم افزایی زهرزنبور-
متفورمین نیز نسبت به گروه کنترل به طور معنی داري کاهش یافت((P <0/01 (نمودار .(4 درصد تکوین هسته
اي و پیشروي تخمکهاي فولیکولها تا مرحله MІ در گروه کنترل((%32، گروه متفورمین((%45/31، گروه زهر زنبور(44/23 درصد) و گروه هم افزایی متفورمین-زهر زنبور(42/37 درصد) بوده است(جدول.(1 درصد تکوین هسته اي تخمک تا مرحله ي MІ در هر سه گروه تیماري نسبت به گروه کنترل افزایش یافت اما این اختلاف معنی دار نبود. بین گروههاي تیماري نیز تفاوت معنی داري مشاهده نشد. درصد تکوین هسته اي و پیشروي تخمکهاي فولیکول تا مرحله ي MІІ در گروه کنترل((%16، گروه متفورمین(23/44 درصد)، گروه زهرزنبور(21/15 درصد) و
گروه هم افزایی متفورمین-زهرزنبور(23/73 درصد) است.
درصد تکوین هسته اي تخمک تا مرحله ي MІІ در هر سه گروه تیماري نسبت به گروه کنترل افزایش یافت اما این اختلاف معنی دار نبود. بین گروههاي تیماري نیز تفاوت معنی داري مشاهده نشد (جدول .(1
