بخشی از مقاله
چکیده
این آزمایش به منظور بررسی اثر کود های فسفره بر بیان ژن پرولین-5 کربوکسیلات ردوکتاز در زعفران، به صورت طرح بلوک کامل تصادفی با 3 تکرار در دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند اجرا شد. تیمارهای کودی شامل شاهد، شیمیایی، زیستی و شیمیایی + زیستی بود. توالی ژن پرولین-5 کربوکسیلات ردوکتاز در زعفران شناسایی و سپس بیان رونوشت آن تحت تیمارهای کودی فسفره مورد بررسی قرار گرفت.
برای جداسازی این ژن آغازگرهایی اختصاصی از گیاه گندم طراحی و سنتز شد. بیان ژن با استفاده از واکنش RT-PCR بررسی شد. همچنین فسفر قابل جذب خاک و فسفر معدنی گیاه نیز در برگ و کورم زعفران اندازه گیری شد.
توالی جدا شده توسط این آغازگرها دارای 280 جفت باز طول بود. فسفر خاک در سطح 5 درصد در تیمار شیمیایی+زیستی بیشترین مقدار را به خود اختصاص داد. در سطح 1 درصد فسفر معدنی برگ بیشترین مقدار را در تیمار شیمیایی+ زیستی داشت و در کورم تیمارهای کودی تاثیری بر فسفر معدنی نداشتند. بیان ژن پرولین-5 کربوکسیلات ردوکتاز در برگ در تیمار کو زیستی در سطح احتمال 1 درصد بیشترین مقدار را به خود اختصاص داد و در کورم تیمارهای کودی بر بیان ژن بی اثر بود.
.1 مقدمه و هدف
زعفران با نام علمی Crocus sativus L. متعلق به خانواده زنبق یک گیاه زراعی با ارزش است که اغلب در مناطقی که اقلیم خشک دارند، کشت می شود - . - 4 این محصول، ادویه ای گران قیمت - 10 - و از با ارزش ترین گونه های گیاهان زراعی در دنیاست
فسفر یکی از عناصر معدنی کلیدی و ضروری برای رشد و نمو گیاه است. همچنین جزء ساختاری اسیدهای نوکلوئیک و فسفولیپید ها بوده و نقش مهمی در انتقال انرژی، انتقال سیگنالی، فتوسنتز و تنفس ایفا می کند . - 14 - فسفر اغلب به صورت فسفات های معدنی کم محلول و یا نامحلول و یا به صورت فسفر آلی در خاک وجود دارد که به سهولت برای گیاهان قابل استفاده نیست. کمبود غلظت فسفات های قابل جذب خاک های زراعی در کشور باعث شده است که از سال ها پیش تا کنون برای رفع کمبود فسفر مورد نیاز گیاهان، این عنصر را به صورت کودهای شیمیایی فسفر دار به خاک اضافه کنند
در چند دهه اخیر مصرف نهادههای شیمیایی در اراضی کشاورزی موجب معضلات زیست محیطی زیادی از جمله آلودگی منابع آب، افت کیفیت محصولات کشاورزی و کاهش میزان حاصلخیزی خاکها گردیده است . - 16 - برای غلبه بر این مشکلات، راهکار بیولوژیکی از استراتژیهای اساسی است که باید مورد توجه قرار گیرد. در این بین میتوان به استفاده از کودهای زیستی اشاره کرد.
پرولین بهعنوان یک اسمولیت سازگار کننده نقش مهمی در تنظیم اسمزی درون سلول، پایدار کردن ساختار پروتئین ها و غشاء سلولی، جاروب کردن گونههای اکسیژن رادیکال - ROS - ، تنظیم pH سلولی و واکنش های اکسیداسیون و احیا، ایفا میکند
در گیاهان پرولین عمدتا از گلوتامات ساخته می شود، که توسط آنزیم پرولین-5 کربوکسیلات سنتتاز - P5CS - به گلوتامات سمی آلدئید تجزیه شده و خود به خود به پرولین-5کربوکسیلات - P5C - تبدیل میشود. آنزیم پرولین-5 کربوکسیلات ردوکتاز - P5CR - ، P5C را به پرولین تجزیه میکند.
در تحقیق حاضر اثر کودهای فسفره بر بیان ژن پرولین-5 کربوکسیلات ردوکتاز، که یکی از آنزیمهای بیوسنتزی این اسید آمینه میباشد مورد بررسی قرار گرفت.
.2 تئوری و پیشینه تحقیق
با توجه به نتایج تحقیق اکبری و همکاران - 2 - که بر روی تاثیر کود فسفره و محلول پاشی کلات آهن در میزان جذب عناصر کم مصرف، میزان پرولین و کربوهیدارت های محلول در گندم نان و تعدادی از گونه های اجدادی گندم در شرایط دیم انجام شد، اثر کود فسفره بر میزان پرولین در اندام های هوایی گندم بسیار معنی دار گردید. همچنین علومی و همکاران در سال 94 در تحقیقی که بر روی تاثیر خاک فسفات بر گیاه آفتابگردان داشتند بیان کردند که غلظت پرولین در ساقه این گیاه تحت تاثیر این نوع فسفر نسبت به ریشه افزایش معنیداری نشان میدهد . - 7 -
.3 مواد و روشها
این تحقیق در دو فاز مزرعه ای و آزمایشگاهی در دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند انجام شد. طرح آزمایشی در قالب بلوک کامل تصادفی و تیمارهای کودی شامل: p1 - شاهد یا عدم مصرف کود فسفره شیمیایی و زیستی - ، p2 - کود شیمیایی فسفاتآمونیوم به میزان 150 کیلوگرم در هکتار - ، p3 - کود زیستی فسفره بارور2 به میزان 100 گرم در هکتار - و p4 - ترکیب کود شیمیایی فسفاتآمونیوم به مقدار 75 کیلوگرم در هکتار و کود زیستی بارور2 به مقدار 50 گرم در هکتار - بود. کشت در شهریورماه صورت گرفت و نمونهبرداری اسفندماه در اواخر رشد سبزینهای زعفران انجام و برگ و کورم از هر کرت جمعآوری و بهصورت فریز شده در ازت مایع به آزمایشگاه منتقل گردید.
فاز آزمایشگاهی این تحقیق با آزمایشات خاکشناسی و تجزیه های فیزیکی و شیمیایی آن شروع شد - جدول. - 1 پس از آن فسفر قابل جذب خاک به روش اولسن برای هر کرت آزمایشی و فسفر غیر آلی - معدنی - کورم و برگ زعفران نیز اندازه گیری شد.
جدول -1 خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک
طراحی و سنتز آغازگر برای ژن P5CR
از آنجایی که توالی ژن P5CR در زعفران هنوز شناسایی نشده بود، با استفاده از گیاه گندم اقدام به طراحی آغازگر برای ژن مورد نظر صورت گرفت توالی ژن P5CR گندم با شماره دسترسی به طول جفتباز از بانک ژن استخراج گردید و با BLAST آن در پایگاه nr/nt تارنمای NCBI، توالیهای همولوگ از گیاهان دیگر که دارای قرابت با زعفران بودند، شناسایی و جمعآوری گردید. در ابتدا توالیهای به دست آمده با برنامه MegAlign نرمافزار DNASTAR همردیف شدند. در این همردیفی مناطق حفاظتشده این ژن مشخص گردید. در مناطق حفاظتشده با نرمافزار Oligo 7 آغازگر مستقیم با توالی 5"- CTG GCT TGA GTG GTA GTG G -3" و آغازگر برگشتی دارای توالی 5"-TGT GGC AGC AAC AAC GGC A -3" طراحی و برای سنتز به شرکت دنازیست آسیا ارسال شد.
جداسازی و تعیین توالی ژن P5CR
برای جداسازی ژن P5CR از Semi-quantitative Reverse Transcription polymerase chain reaction استفاده شد. بدین منظور با استفاده از آغازگرهای F588P5CR-TA و R845P5CR-TA طراحی شده و cDNA واکنش PCR انجام شد.
برنامه واکنش بهصورت واسرشتهسازی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه، واسرشته شدن الگوها در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، اتصال آغازگرها در دمای 59,2 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه برای 35 چرخه، تکثیر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه بود. سپس محصول واکنش بر روی ژل آگارز 1 درصد ران و نوارهای حاصل با استفاده از کیت شرکت یکتا تجهیز آزما از روی ژل خالص سازی گردید. DNA خالص شده برای تعیین توالی ژن مورد نظر به شرکت دنازیست آسیا ارسال گردید.
برای تایید صحت توالی تکثیر شده میتوان از روشهای زیستدادهپردازی استفاده گردید. توالی خوانش شده برای این ژن با توالی ژن P5CR در بسیاری از گونه های گیاهی دیگر مشابه بود و همچنین واجد دمین پروتئینی این ژن نیز بود. از این رو توالی مورد نظر در بانک ژن به عنوان توالی ژن P5CR زعفران ثبت گردید.
بررسی بیان ژن P5CR
به منظور بررسی بیان ژن P5CR از نمونه های جمعآوری شده از هر کرت طرح آزمایشی، استخراج RNA به روش دستی با استفاده از CTAB انجام گرفت. سپس با استفاده از کیت شرکت یکتا تجهیز آزما ساخت cDNA انجام شد.
برای حصول اطمینان از کیفیت cDNA های سنتز شده ابتدا با آغازگرهای F3ActLS و R562ActLS واکنش PCR انجام و نوارهای تشکیل شده بر روی ژل آگارز پس از الکتروفورز در دو نوبت ابتدا با ژن اکتین همرقت شدند. با توجه به واکنش PCR اول و دوم برای ژن اکتین و مقدار ران کردن محصولات آنها بر روی ژل آگارز واکنش اول و دوم PCR برای آغازگرهای P5CR نیز انجام شد - شکل . - 2 مقدار cDNA مورد استفاده برای هر نمونه همانند واکنشهای اکتین بود.
