بخشی از مقاله
چکیده
به منظور استفاده از روش کشت بافت و الیسیتورها براي افزایش سطح و حجم کالوس و تولید متابولیتهاي ثانویه مهم در گیاه زعفران آزمایشی در قالب طرح فاکتوریل در آزمایشگاه ژنتیک دانشکده کشاورزي و منابع طبیعی دانشگاه تهران انجام شد. در این پژوهش لیزر کمتوان هلیوم نئون به عنوان الیسیتور درالقا تولید متابولیتهاي کروسین، پیکروکروسین و سافرانال مورد استفاده قرار گرفت. از نتایج آنالیز HPLC کالوسهاي تیمار شده با لیزر کم توان هلیوم نئون مشخص شد که مقدار کروسین، پیکروکروسین و سافرانال پس از تیمار با لیزر اقزایش یافته است.
بهترین تیمار از نظر افزایش سطح و حجم ومجموع متابولیتهاي ثانویه ، تیمار لیزر کم توان هلیوم نئون دو میلیوات به مدت پنج دقیقه بود که بیشترین مقدار تجمع کروسین و سافرانال را نسبت به شاهد داشت.
واژگان کلیدي :الیسیتور، حجم کالوس، سطح کالوس، لیزرهلیوم نئون، متابولیتهاي ثانویه
مقدمه
کشت بافت گیاهی با تکثیر انبوه و سریع گیاهان یکنواخت از نظر محتوي ژنتیکی و کیفی کاربرد فروانی دارد به طوریکه امروزه کشت بافت روش مناسب و مفید در اصلاح ژنتیکی زعفران به حساب می آید. براي افزایش سطح و حجم کالوس ها و همچنین افزایش مقدار متابولیتهاي ثانویه از جمله کروسین میتوان از القا الیسیتورها به کالوسهاي زعفران در کشت درون شیشهاي استفاده کرد. الیسیتورها ترکیبات خاصی هستند که موجب تولید متابولیتهاي ثانویه و پرتئینهاي مقاومت به بیماريهاي گیاهی میشوند.
تاکنون محققان زیادي از الیسیتورهاي مختلف براي القا تولید متابولیتهاي ثانویه استفاده کرده اند، از این مطالعات میتوان به بررسی اثرات الیسیتورهایی مانند متیل جاسمونات و فراصوت - - 3، لیزر کم توان هلیوم نئون بر گیاه آلوئهورا ، عناصر نادري مانندLa3+ و Ce3 و ترکیبات این عناصر بر گیاه زعفران اشاره کرد . هدف از این پژوهش استفاده از روش کشت بافت و الیسیتورها براي تولید متابولیت هاي مهم در گیاه زعفران از جمله کروسین ، پیکروکروسین و سافرانال، یافتن موثرترین طول موج ، توان و مدت زمان تیمار توسط لیزر کمتوان هلیوم نئون بود.
مواد و روش ها
براي تهیه ریز نمونه ها کشت بافت از بنههاي تهیه شده از منطقه قائنات استان خراسان الیافزدایی و با محلول کلرید جیوه به غلظت یک میلیگرم در لیتر به مدت 20 دقیقه استریل شد. ریز نمونه ها به منظور تولید کالوس برروي محیط کشت پایه MS با ترکیب هورمونی یک میلیگرم 2,4-D و یک میلیگرم BAP به همراه ویتامین C قرار داده شد. الیسیتور مورد استفاده در این پژوهش لیزر کمتوان هلیوم نئون بود. کالوسهاي شکري و زرد رنگ کشت شده در پتري شیشهاي در پژوهشکده علوم و فنون هسته اي تحت تیمار با لیزر هلیوم نئون قرار گرفتند.
طول موج لیزر 632/8 نانومتر ، اندازه لکه لیزر یک میلیمتر و فاصله نمونه از خروجی لیزر 20 سانتیمتر بود. براي تیماردهی با لیزر هلیوم نئون ، دو توان مختلف که عبارتند از یک و دو میلیوات در نظر گرفته شد ، براي هر توان پنج زمان مختلف مدت تیماردهی شامل 0، 1، 3، 5، 10 دقیقه انجام شد. تغییرات مورفولوژیکی از جمله تغییرات سطح و حجم کالوس قبل از تیمار با لیزر کمتوان هلیومنئون و بعد از تیماردهی اندازه گیري شد.
کالوسهاي تیمار شده با لیزر کمتوان هلیوم نئون براي سنجش میزان متابولیتهاي ثانویه به دانشکده تربیت معلم تهران بردهشد. در این مرکز با استفاده از روش کروماتوگرافی با کارایی بالا - HPLC - مقدار متابولیتهاي ثانویه سنجیده شدند. نرم افزارهاي مورد استفاده در این پژوهش spss و exel بود. نتایج و بحث در بررسی تجزیه واریانس تغییرات سطح و حجم مشخص شد که بین دوزهاي مختلف لیزر ، نمونههاي تیمار شده و شاهد تفاوت معنی داري وجود دارد. به صورتیکه افزایش سطح و حجم در توان دو میلیوات بسیار بیشتر از توان یک میلیوات بود.
با توجه به شکل شماره یک و دو، تیمار لیزر کمتوان هلیومنئون دو میلیوات به مدت 5 دقیقه بیشترین افزایش سطح و حجم را داشت که این نتیجهگیري با مطالعات توکلی و امیدي - 1393 - بروي گیاه آلوئه ورا مطابقت ندارد .
مقایسه میانگین افزایش حجم کالوسهاي تیمار شده با لیزر کمتوان هلیومنئون در کشت درون شیشهاي گیاه زعفران از لحاظ کمترین میزان افزایش سطح و حجم با توجه به شکلهاي شماره یک و دو نیز میتوان به تیمار لیزر کم توان هلیوم نئون یک میلیوات به مدت 10دقیقه اشاره کرد که این نتیجه با پژوهش توکلی و همکاران برروي گیاه آلوئه ورا مطابقت دارد مقایسه میانگین افزایش سطح کالوسهاي تیمار شده با لیزر کمتوان هلیومنئون در کشت درون شیشهاي گیاه زعفران مشاهده شد که بیشترین میزان کروسین و سافرانال در کالوس تیمار شده با لیزر کم توان هلیوم نئون 2 میلی وات به مدت 5 دقیقه بود.
مقدار کروسین در این تیمار افزایش 1/8 و مقدار سافرانال افزایش 3/2 برابري نسبت به شاهد داشتند. در بررسی مقدار پیکروکروسین در شکل شماره 3 مشاهده شد که تیمار لیزر کمتوان هلیومنئون 2 میلیوات به مدت 3 دقیقه بیشترین مقدارپیکروکروسین را دارا بود که نسبت به شاهد افزایش 2/75 برابري داشت. از نتایج حاصل از این تحقیق بدست آمد که بهترین زمان تیماردهی با اشعه لیزر هلیوم نئون سه و پنج دقیقه میباشد که با نتایج حاصل از تحقیق توکلی وهمکاران مشابه است .
پس به نظر میرسد که براي تیمار با نور و اشعه لیزر هلیوم نئون مدت زمان مشخصی را باید در نظر گرفت و اگر بیشتر از مدت زمان بهینه تیماردهی انجام شود نه تنها موجب افزایش سطح ، حجم و متابولیت هاي ثانویه نمیشود بلکه در برخی موارد حتی میزان متابولیتهاي ثانویه از نمونه شاهد نیز کمتر میشود. مقایسه مقدار سافرانال، کروسین و پیکروکروسین در کالوسهاي تیمار شده با لیزر کم توان هلیوم نئون در کشت درون شیشهاي گیاه زعفران به طور کلی لیزر کمتوان مورد استفاده در این پژوهش همانند پژوهش توکلی و همکاران در سال 1393 به طور معنی داري باعث افزایش میزان متابولیتهاي ثانویه شد این الیسیتور کم هزینه، کم عوارض و دردسترس بود که در مدت زمان بسیار کم موجب افزایش میزان معنی دار متابولیت هاي ثانویه شد.
